PI3K-PKB信號通路及其抑制劑wortmannin在大鼠急性胰腺炎相關(guān)腎損傷中的作用.pdf

1、急性胰腺炎(Acute pancreatitis AP)中重癥急性胰腺炎(Severacute pancreatitis SAP)占1O％-25％，病死率高達20％-30％左右，常伴多器官功能障礙綜合癥(Multiple-organ dysfunction syndrome MODS)。其中急性腎功能障礙發(fā)生率僅次于急性肺功能障礙，大約為14％～43％。關(guān)于AP腎損傷的發(fā)病機制目前仍不十分清楚，腎血流動力學(xué)的改變及腎微循環(huán)障礙、細(xì)菌移位

2、和內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、氧自由基等多種因素參與了重癥急性胰腺炎并腎損害的發(fā)展過程。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol3-kinase PI3K)是一種與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的第二信使，蛋白激酶B(protein kinase B PKB)是PI3K的一個下游作用因子，PI3K/PKB信號通路是一個重要的信號調(diào)控系統(tǒng)，可介導(dǎo)細(xì)胞外信號引起細(xì)胞反應(yīng)，在腫瘤的發(fā)生，炎癥細(xì)胞的活化，趨化，缺血再灌注，間質(zhì)纖維化等方

3、面發(fā)揮了重要作用。近年來PI3K/PKB信號通路與胰腺炎的關(guān)系引起更多關(guān)注，PI3K/PKB信號通路通過促進Ca2+由鈣庫釋放入胞質(zhì)，參與了胞內(nèi)鈣超載的形成，進而激活胰蛋白酶原，參與胰腺炎的發(fā)生。同時有研究表明，該信號通路通過促進中性粒細(xì)胞的募集及產(chǎn)生TNF-α、IL-1β等大量炎癥介質(zhì)，加重了急性胰腺炎時的胰腺損傷。通常情況下磷酸化的PKB可衡量PI3K/PKB信號通路的活化程度。本實驗通過測定腎組織中磷酸化PKB(phophoryl

4、ated protein kinase B，p-PKB)及PKB的表達水平，進而研究PI3K/PKB信號通路與大鼠AP相關(guān)腎損傷的關(guān)系，同時應(yīng)用PI3K信號通路抑制劑wortmannin干預(yù)AP大鼠，觀察其在AP大鼠并發(fā)腎損傷的作用并研究其可能的機制。
　　 目的：通過應(yīng)用PI3K的特異性抑制劑wortmannin預(yù)處理大鼠AP模型，探討wortmannin在急性胰腺炎相關(guān)腎損傷中的作用，并研究其可能的作用機制。
　　

5、方法：將健康成年SD大鼠54只隨機分為對照組(sham operation，SO)、急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)組和AP+wortmannin(WAP)組，每組18只，每組又以不同時間點3h、6h、12h分為三個亞組，每個亞組6只大鼠。以10％的水合氯醛腹腔注射麻醉，取上腹正中切口進入腹腔，以無創(chuàng)動脈夾夾閉近肝門端胰膽管，應(yīng)用以0.2ml/min速度逆行胰膽管注射50g/L?；悄懰徕c制備AP模型(1ml/kg

6、)。推藥后以左手拇指捏閉胰管入十二指腸處，觀察3min，去除動脈夾，其中AP組于造模前4小時腹腔注射wortmannin(0.35mg/kg)。SO組和AP組均于造模前4小時腹腔注射DMSO(dimethylsulfoxide)(0.35mg/kg)，DMSO為wortmannin的溶劑。分別于建模后3h，6h，12h每組于無菌環(huán)境下處死6只大鼠，下腔靜脈取血，檢測血清TNF-α( tumour necrosis factor-α)水平

7、、血清淀粉酶、肌酐、尿素氮的水平，并留取腎臟和胰腺以觀察胰腺和腎臟的大體及病理學(xué)改變，并檢測腎組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，通常情況下PKB的磷酸化可衡量PI3K的活性，采用western blot檢測腎組織中PKB及p-PKB(phosphorylated protein kinase B)的表達水平，觀察PI3K/PKB信號通路與大鼠AP相關(guān)腎損傷的關(guān)系，及應(yīng)用wortmannnln預(yù)處理AP大鼠后

8、上述測量指標(biāo)的變化。
　　 結(jié)果：SO組的各測量指標(biāo)在各時間點無明顯變化，AP組在各時間點較SO組血清TNF-α水平，血清淀粉酶、肌酐、尿素氮，及腎MPO活性均顯著升高(P＜0.05)，胰腺、腎病理損傷亦較SO組明顯加重：AP組的腎組織在各時間點的中性粒細(xì)胞的浸潤隨時間的延長而增多。WAP組在各時間點較SO組各項指標(biāo)均升高，但與AP組相比均明顯降低(P＜0.05)。
　　 本實驗中應(yīng)用MPO代表中性粒細(xì)胞的浸潤程度，SO

9、組大鼠在3h、6h、12h各時間點，腎臟MPO活性測定為：(1.04±0.17)U/g、(1.02±0.17)U/g、(1.05±0.19);AP組分別為(2.12±0.26)U/g、(7.45±0.41)U/g、(9.97±0.23)U/g;WAP組分別為(1.59±0.20)U/g、(4.48±0.23)U/g、(6.14±0.20)U/g。MPO的活性在各時間點，SO組無顯著變化，AP組各時間點MPO活性較SO組明顯升高(P＜0.

10、05)，隨時間延長逐漸增高；WAP組較之AP組比較明顯下降(P＜0.05)，但仍較前SO組明顯增高(P＜0.05)。
　　 不同時間點各組血清TNF-α為：在3h、6h、12h各時間點，SO組分別為(78.2±17.62)ng/L、(75.86±16.58)ng/L、(67.13±12.55)ng/L;AP組分別為(274.57±22.37)ng/L、(500.39±30.96)ng/L、(764.83±41.61)ng/L;W

11、AP組分別為(170.60±25.99)ng/L、(312.31±35.66)ng/L、(397.21±33.45)ng/L。在各時間點，SO組TNF-α無顯著變化，AP組各時間點血清TNF-α濃度較SO組明顯升高(P＜0.05)，隨時間延長逐漸增高；WAP組血清TNF-α濃度較之AP組比較明顯下降(P＜0.05)，但仍較前SO組明顯增高(P＜0.05)。
　　 western blot檢測腎組織中PKB的表達在三個組比較沒有明

12、顯差別，而p-PKB的表達，在AP組和WAP組均較正常對照組明顯升高，WAP組較AP組明顯降低(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：AP大鼠模建立后，胰腺組織出現(xiàn)病理損傷，炎癥細(xì)胞的浸潤及壞死程度隨時間的延長而加重，說明AP模型建立成功，引發(fā)AP時，大鼠腎組織中p-PKB的水平明顯升高，表明PI3K/PKB信號通路參與了AP大鼠相關(guān)腎損傷的發(fā)生發(fā)展，應(yīng)用wortmannin預(yù)處理AP大鼠后，腎組織中p-PKB的水平較AP組明顯下降，說