脂聯(lián)素抑制胰島β細(xì)胞脂性調(diào)亡及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分胰島β細(xì)胞的脂性凋亡及其機(jī)制
　　 目的:證實(shí)脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡;探討脂毒性誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的途徑。
　　 方法:體外培養(yǎng)胰島β細(xì)胞，隨機(jī)化分為:
　　 ①正常對(duì)照組(BSA):含0.5％BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)。②棕櫚酸組(PA):加入0.4mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時(shí)。③油酸脂組(OA):加入0.4mmol/l的油酸脂(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時(shí)。④Z-LEH

2、D-FMK組(LEHD):40uM Z-LEHD-FMK預(yù)孵2小時(shí)后，加入0.4mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時(shí)。⑤Z-IETD-FMK組（IETD）:40uM Z-IETD-FMK預(yù)孵2小時(shí)后，加入0.4mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時(shí)。⑥Z-LEHD-FMK聯(lián)合Z-IETD-FMK(LEHD/IETD)組:40uM Z-LEHD-FMK及40uMZ-IETD-FMK聯(lián)合預(yù)孵2小時(shí)后，加入0.4

3、mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時(shí)。
　　 采用Annexin V-Cy3凋亡試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Western blotting檢測(cè)Cleaved caspase-3、8、9蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:與對(duì)照組及油酸脂組比較，棕櫚酸組Cleaved caspase3的表達(dá)增加(p＜0.05)，凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加(p＜0.01)，且內(nèi)源性凋亡途徑的Cleaved caspase8(p＜0.05)及外源性

4、凋亡途徑的Cleaved caspase9表達(dá)也增加(p＜0.01)，而Cleaved caspase9的升高更顯著。使用Caspase抑制劑后發(fā)現(xiàn)，Z-LEHD-FMK（Caspase9抑制劑）顯著減少Cleavedcaspase3的表達(dá)(p＜0.05)，而Z-IETD-FMK（Caspase8抑制劑）對(duì)Cleaved caspase3的表達(dá)有減少趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)使用Z-LEHD-FMK（Caspase9抑制劑）及Z-IE

5、TD-FMK(Caspase8)不能完全抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的Cleaved caspase3的表達(dá)。
　　 結(jié)論:脂毒性通過同時(shí)激活內(nèi)源性及外源性凋亡途徑導(dǎo)致胰島β細(xì)胞凋亡，其中內(nèi)源性凋亡途徑可能起著主要作用。脂毒性誘導(dǎo)的Cleaved caspase3激活中可能還存在非Caspase8及Caspase9的誘導(dǎo)因素。
　　 第二部分脂聯(lián)素抗脂性凋亡及其機(jī)制
　　 目的:證實(shí)脂聯(lián)素的抗凋亡特性;初步探討脂聯(lián)素抗脂性凋亡

6、的機(jī)制。
　　 方法:體外培養(yǎng)胰島β細(xì)胞，隨機(jī)分為①正常對(duì)照組(BSA):含0.5％BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時(shí)。②棕櫚酸組(PA):加入0.4mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時(shí)。③脂聯(lián)素組OA）:加入脂聯(lián)素預(yù)孵2小時(shí)后，加入0.4mmol/l的棕櫚酸(含0.5％BSA)培養(yǎng)24小時(shí)。
　　 采用Annexin V-Cy3凋亡檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，Western blotting檢測(cè)Cleaved c

7、aspase-3、8、9及Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:與單純棕櫚酸組比較，脂聯(lián)素預(yù)孵后Cleaved caspase3的表達(dá)減少、胰島β細(xì)胞凋亡數(shù)目減少(p＜0.01); Cleaved caspase9表達(dá)減少(p＜0.05);而Cleaved caspase8的表達(dá)有減少趨勢(shì)，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。脂聯(lián)素預(yù)孵后，Bax表達(dá)減少， Bcl-2表達(dá)增加(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:脂聯(lián)素具有抗脂性凋亡的作用

8、，脂聯(lián)素對(duì)內(nèi)源性及外源性凋亡途徑均有抑制作用，但對(duì)內(nèi)源性凋亡途徑的抑制作用可能起著主要作用。脂聯(lián)素通過調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2的表達(dá)抑制內(nèi)源性凋亡途徑。
　　 第三部分表達(dá)小鼠脂聯(lián)素蛋白的重組慢病毒載體干預(yù)糖尿病
　　 目的:構(gòu)建表達(dá)小鼠脂聯(lián)素的重組慢病毒載體;通過慢病毒載體提高血循環(huán)脂聯(lián)素濃度;探討提高血循環(huán)脂聯(lián)素濃度對(duì)糖尿病的干預(yù)作用。
　　 方法:構(gòu)建表達(dá)小鼠全長(zhǎng)脂聯(lián)素蛋白的重組慢病毒載體（攜帶綠色熒光蛋白）

9、。小劑量鏈脲菌素多次注射聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)建立2型糖尿病小鼠模型。隨機(jī)分組:(1)正常對(duì)照組(Control):普通飲食喂養(yǎng)6周。(2)2型糖尿病組:小鼠禁食16小時(shí)后腹腔注射鏈尿菌素（55mg/kg體重，每天一次，連續(xù)5天），繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)4周。以隨機(jī)血糖濃度＞16.7mmol/L為糖尿病造模成功標(biāo)準(zhǔn)。4周后成膜的糖尿病小鼠隨機(jī)分為①生理鹽水注射組(Saline):尾靜脈注射生理鹽水100ul，繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)2周。②脂聯(lián)素干預(yù)組(P

10、lenti-Acdc-EGFP):尾靜脈注射表達(dá)小鼠脂聯(lián)素的重組慢病毒載體100ul，病毒滴度為1×108 ifu/ml，繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)2周。③空病毒載體注射組(Plenti-EGFP):尾靜脈注射空病毒載體100ul，繼續(xù)高脂飲食喂養(yǎng)2周。
　　 采用熒光顯微鏡觀察肝臟綠色熒光表達(dá)情況;Western blotting檢測(cè)肝臟脂聯(lián)素蛋白的表達(dá);Elisa法檢測(cè)血循環(huán)中脂聯(lián)素的水平;TUNEL法檢測(cè)胰島凋亡;免疫組化檢測(cè)Cle

11、aved caspase3、8、9的表達(dá);化學(xué)法檢測(cè)血脂水平。指血糖儀檢測(cè)血糖水平。
　　 結(jié)果:小劑量多次鏈脲菌素注射聯(lián)合高脂飲食喂養(yǎng)法成功建立了2型糖尿病小鼠模型，其血脂、血糖水平明顯高于正常對(duì)照組(p＜0.01)。
　　 慢病毒尾靜脈注射14天后，肝組織冰凍切片，熒光顯微鏡下見大量綠色熒光表達(dá)于脂聯(lián)素干預(yù)組及空病毒載體注射組，而正常對(duì)照組及生理鹽水注射組未見綠色熒光表達(dá)。Western blotting顯示僅脂聯(lián)素

12、干預(yù)組見脂聯(lián)素蛋白表達(dá)。Elisa檢測(cè)結(jié)果顯示脂聯(lián)素干預(yù)組血脂聯(lián)素水平明顯高于其他三組(p＜0.01)，為48.03±3.79ug/ml，空病毒載體組與生理鹽水組水平相似，但顯著低于正常對(duì)照組(p＜0.05)。
　　 與正常對(duì)照組比較，生理鹽水注射組及空病毒注射組體重下降、血糖、血脂水平升高(p＜0.01)。生理鹽水注射組及空病毒注射組兩組間比較，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義。
　　 與生理鹽水注射組及空病毒注射組比較，脂聯(lián)素干預(yù)