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文檔簡介
1、前言:
目前脂毒性被認(rèn)為是2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus,T2DM)的主要發(fā)病機(jī)制之一。生理?xiàng)l件下,一定的糖和脂對于胰島功能的維持是必不可少的。但是,慢性持續(xù)性的處在高脂環(huán)境中卻可引發(fā)胰島β細(xì)胞胰島素基因表達(dá)受損,胰島素合成、分泌減少及細(xì)胞凋亡。而β細(xì)胞凋亡異常增多則是導(dǎo)致β細(xì)胞數(shù)目減少的重要原因之一。因此從保護(hù)胰島β細(xì)胞的角度看,維持胰腺組織中殘存β細(xì)胞的功能及數(shù)量,對阻止糖尿病的進(jìn)展至關(guān)重要
2、。鑒于β細(xì)胞的凋亡及脂毒性在糖尿病病理生理機(jī)制中的重要地位和作用,開展相關(guān)藥物有關(guān)對抗脂毒性損傷作用的研究便具有重要意義。
胰高血糖素樣肽-1(Glucagon like peptide-1,GLP-1)是一種生理性肽類激素,主要由回腸末端、結(jié)腸和直腸中的神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞L細(xì)胞分泌。無論在動物還是在糖尿病患者體內(nèi),GLP-1均可通過和β細(xì)胞上的GLP-1受體結(jié)合,增強(qiáng)葡萄糖依賴的胰島素分泌。此外,近年來研究發(fā)現(xiàn),GLP-1還
3、具有其他一些重要的生物學(xué)功能,包括調(diào)控胰島β細(xì)胞特異性基因表達(dá),促進(jìn)其分化增殖及再生,抑制凋亡,有效的保護(hù)胰島β細(xì)胞的數(shù)量及功能等。而無論是1型還是2型糖尿病,胰島β細(xì)胞數(shù)量和功能都對其臨床進(jìn)程起著重要作用,故GLP-1及其類似物被認(rèn)為是糖尿病治療具有前景的重要物質(zhì)之一。Exendin-4是GLP-1受體的長效激動劑,能發(fā)揮與GLP-1相近的血糖調(diào)節(jié)作用,并具有相似的抗細(xì)胞凋亡、促胰島細(xì)胞增殖作用。而對于T2DM的主要機(jī)制之一,脂毒性誘
4、導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡,Exendin-4能否發(fā)揮其保護(hù)作用,改善β細(xì)胞數(shù)量及功能,目前報道尚少,因此本研究的目的主要是探討Exendin-4能否保護(hù)胰島β細(xì)胞拮抗脂毒性的毒副作用以及對相關(guān)機(jī)制的探索。
本實(shí)驗(yàn)共分如下三部分進(jìn)行:
第一部分:采用體外培養(yǎng)的小鼠胰腺β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞,用游離脂肪酸(Freefatty acid,F(xiàn)FA)(棕櫚酸)處理,探討脂毒性對胰島β細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長、凋亡等方面的影響。
5、r> 第二部分:應(yīng)用FFA(棕櫚酸)建立體外的脂毒性環(huán)境,然后用GLP-1受體激動劑Exendin-4處理,探討Exendin-4對胰島β細(xì)胞株生長、凋亡的影響。
第三部分:探討Exendin-4拮抗脂毒性凋亡的相關(guān)機(jī)制。
第一部分游離脂肪酸誘導(dǎo)小鼠胰島β細(xì)胞凋亡的研究
前言:
T2DM中常伴有脂質(zhì)代謝紊亂,高FFA血癥是肥胖相關(guān)的T2DM代謝紊亂的特征之一。長期處于高FFA
6、環(huán)境中可使周圍組織對胰島素的敏感性降低,并使胰島β細(xì)胞功能受損,使胰島素合成與分泌減少,最終導(dǎo)致胰島素抵抗和胰島素分泌障礙。另外FFA長期升高對胰島β細(xì)胞的毒性作用可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡及壞死,使細(xì)胞數(shù)目減少。動物實(shí)驗(yàn)和人體研究均發(fā)現(xiàn),胰島β細(xì)胞凋亡增加可能是T2DM胰島β細(xì)胞分泌胰島素功能不足的主要原因。因此高FFA誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡作用應(yīng)受到重視。
本研究以小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞作為研究對象,選用體內(nèi)FFA含量比
7、例較高的棕櫚酸為代表建立脂環(huán)境,探索脂毒性對胰島β細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長、凋亡等方面的影響。
實(shí)驗(yàn)方法:
以小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞作為研究對象,通過不同濃度棕櫚酸誘導(dǎo)刺激,探索脂毒性對胰島β細(xì)胞的損傷作用。CCK8檢測不同濃度棕櫚酸(0.1-0.5mM)作用不同時間(24h、48h)對MIN6細(xì)胞活性的影響,Hoechst33258熒光染色法、Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法檢測不同濃
8、度棕櫚酸(0.1、0.2、0.4mM)作用24h后細(xì)胞的凋亡率,酶聯(lián)法檢測不同濃度棕櫚酸(0.1、0.2、0.4mM)作用24h后細(xì)胞Caspase-3酶活性,電鏡觀察細(xì)胞凋亡的微觀結(jié)構(gòu)。
結(jié)果:
1、不同濃度棕櫚酸作用MIN6細(xì)胞24h及48h,可明顯抑制MIN6細(xì)胞的生長,并呈一定的時效和量效關(guān)系。
2、隨著棕櫚酸濃度的逐漸升高,其誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡和促進(jìn)Caspase-3活性升高的作用逐
9、漸增強(qiáng)。
3、電鏡觀察棕櫚酸的毒性使胰島β細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重受損,核皺縮,染色質(zhì)凝聚,胞漿中的分泌顆粒減少或消失。
結(jié)論:
棕櫚酸可抑制胰島β細(xì)胞MIN6的細(xì)胞活性,并呈一定的時效和量效關(guān)系。其產(chǎn)生的脂毒性濃度依賴性的誘導(dǎo)了MIN6細(xì)胞凋亡,升高了MIN6細(xì)胞的Caspase-3活性,并可引起細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的改變。
第二部分Exendin-4對棕櫚酸誘導(dǎo)的小鼠胰島β細(xì)胞凋亡的影響
10、 前言:
GLP-1主要在小腸組織中表達(dá),由30多個氨基酸殘基組成,是腸促胰素的主要成分。GLP-1可以迅速降低空腹及餐后血糖水平,具有葡萄糖依賴性的促進(jìn)胰島素分泌,抑制胰高血糖素生成釋放,延遲胃排空、抑制食欲等生理功能。此外,近年來研究發(fā)現(xiàn),GLP-1還具有其他一些重要的生物學(xué)功能,它可調(diào)控胰島β細(xì)胞特異性基因表達(dá),促進(jìn)其分化增殖及再生,抑制凋亡,有效的保護(hù)胰島β細(xì)胞的數(shù)量及功能等。而無論是1型還是2型糖尿病,胰島β
11、細(xì)胞數(shù)量和功能都對其臨床進(jìn)程起著重要作用,故GLP-1被認(rèn)為是糖尿病治療具有前景的重要物質(zhì)之一。Exendin-4是GLP-1受體的長效激動劑,有53%的氨基酸序列與哺乳動物GLP-1重疊,能發(fā)揮與GLP-1相近的血糖調(diào)節(jié)作用,并具有相似的抗細(xì)胞凋亡及促胰島細(xì)胞增殖作用。動物實(shí)驗(yàn)表明,Exendin-4可以耐受體內(nèi)二肽基肽酶Ⅳ(DipeptidylpeptidaseⅣ,DPP-Ⅳ)的降解,與GLP-1相比具有更長的血漿半衰期,這些特點(diǎn)都
12、為GLP-1及其類似物應(yīng)用于臨床治療提供了新的契機(jī)。而對于T2DM的主要機(jī)制之一,脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡,Exendin-4能否發(fā)揮保護(hù)作用,改善細(xì)胞數(shù)量及功能,目前相關(guān)報道尚少,因此有待進(jìn)一步的探索研究。
本研究在體外環(huán)境培養(yǎng)胰島β細(xì)胞株MIN6,應(yīng)用棕櫚酸建立脂毒性環(huán)境,探討Exendin-4對胰島β細(xì)胞生長、凋亡的影響。
實(shí)驗(yàn)方法:
在脂毒性條件下,以不同濃度Exendin-4處理細(xì)胞
13、,觀察Exendin-4對棕櫚酸誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞脂性凋亡的保護(hù)作用。在脂毒性環(huán)境下(棕櫚酸0.4mM),CCK8檢測不同濃度Exendin-4(1、10、100、500nM)作用24h時間后對MIN6細(xì)胞活性的影響,Hoechst33258熒光染色法、AnnexinV-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)、TUNEL法檢測Exendin-4(100nM)作用24h后細(xì)胞的凋亡率,酶聯(lián)法檢測Exendin-4(100nM)作用24h后細(xì)胞Caspase-
14、3酶活性。
結(jié)果:
1、在脂毒性條件下,隨著Exendin-4濃度的升高,細(xì)胞存活率明顯升高,并呈一定量效關(guān)系,在Exendin-4濃度為100nM時,其促進(jìn)細(xì)胞生長作用最強(qiáng)(P<0.01)。
2、在脂毒性條件下,Exendin-4能顯著拮抗棕櫚酸誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡(P<0.01),并抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的Caspase-3活性(P<0.01)。
結(jié)論:
Exendin-
15、4可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞MIN6生長,在脂毒性條件下提高細(xì)胞活性。同時Exendin-4可拮抗脂毒性誘導(dǎo)的MIN6細(xì)胞凋亡,并降低MIN6細(xì)胞的Caspase-3活性。
第三部分Exendin-4拮抗脂毒性保護(hù)胰島β細(xì)胞的機(jī)制研究
前言:
蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB)與細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(Extracellularregulated protein kinases,ERK)
16、分別是在多種組織和細(xì)胞中表達(dá)的一類絲氨酸/蘇氨酸激酶。在胰島中可促進(jìn)β細(xì)胞的增殖,阻斷細(xì)胞凋亡通路。大量實(shí)驗(yàn)證明了它們在調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)方面扮演著重要的角色。不斷有證據(jù)顯示,通過其自身磷酸化的激活可保護(hù)胰島β細(xì)胞抵抗糖脂毒性的毒副作用。我們的研究顯示Exendin-4對于T2DM的主要機(jī)制之一,脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用,而Exendin-4這種保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用機(jī)制是否是通過上述信號通路得以實(shí)施,有待于進(jìn)一步的研
17、究。
實(shí)驗(yàn)方法:
1、采用Western blot法檢測在脂環(huán)境下(棕櫚酸0.4mM),Exendin-4干預(yù)不同時間、不同濃度(1、10、100、500nM)及在各自信號通路阻斷劑存在的條件下,MIN6細(xì)胞內(nèi)p-PKB(ser473)、總PKB,p-ERK1/2、總ERK1/2蛋白水平的表達(dá)。再以CCK8檢測細(xì)胞活性,Hoechst33258熒光染色法、TUNEL法檢測細(xì)胞的凋亡情況。2、采用Real-ti
18、me RT-PCR技術(shù)檢測在脂環(huán)境下(棕櫚酸0.4mM)及Exendin-4(100nM)干預(yù)24h后Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的表達(dá)。
結(jié)果:
1、0.4mM棕櫚酸干預(yù)MIN6細(xì)胞24h后可見PKB蛋白的磷酸化明顯受到抑制(P<0.01),而加入100nM的Exendin-4處理細(xì)胞后,可見PKB蛋白磷酸化的快速激活,在30min處達(dá)到作用高峰(P<0.05)。Exendin-4濃度依賴性的誘導(dǎo)
19、了PKB蛋白磷酸化的激活,100nM濃度時作用最顯著(P<0.01)。Exendin-4誘導(dǎo)的PKB蛋白磷酸化的激活能顯著被PI3K特異性阻斷劑(LY294002)所阻斷(P<0.05)。并且,應(yīng)用Hoechst33258染色法和TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡證明,Exendin-4抑制脂毒性誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用被PI3K阻斷劑所阻斷(P<0.01)。
2、0.4mM棕櫚酸干預(yù)MIN6細(xì)胞24h后可見ERK1/2蛋白的
20、磷酸化明顯受到抑制(P<0.05),而加入100nM的Exendin-4處理細(xì)胞后,可見ERK1/2蛋白磷酸化的快速激活,在5min處達(dá)到作用高峰(P<0.01)。Exendin-4濃度依賴性的刺激了ERK1/2蛋白磷酸化的激活,100nM濃度時作用最顯著(P<0.01)。Exendin-4誘導(dǎo)的ERK1/2蛋白磷酸化的激活顯著被其阻斷劑(PD98059)所阻斷(P<0.05)。并且應(yīng)用CCK8檢測細(xì)胞存活率及Hoechst33258染
21、色法檢測細(xì)胞凋亡證明,Exendin-4促進(jìn)細(xì)胞生長的作用被ERK1/2阻斷劑所阻斷(P<0.05),且Exendin-4抑制脂毒性誘導(dǎo)MIN6細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用同樣被ERK1/2阻斷劑所顯著阻斷(P<0.05)。
3、棕櫚酸可顯著下調(diào)Bcl-2 mRNA的表達(dá)(P<0.01),上調(diào)Bax mRNA的表達(dá)(P<0.01)及促進(jìn)Caspase-3活性(P<0.01)。而加入100nMExendin-4能顯著促進(jìn)Bcl-2 m
22、RNA的表達(dá)(P<0.05),并同時抑制Bax mRNA的表達(dá)(P<0.05)及Caspase-3活性(P<0.01)。
結(jié)論:
1、Exendin-4保護(hù)MIN6細(xì)胞拮抗棕櫚酸誘導(dǎo)的脂性凋亡與PI3K/PKB信號通路有關(guān)。
2、Exendin-4保護(hù)MIN6細(xì)胞、拮抗脂毒性作用與ERK1/2信號通路有關(guān)。
3、脂毒性條件下,Exendin-4的抗凋亡作用涉及線粒體途徑。
23、 小結(jié)
本研究以小鼠胰島β細(xì)胞株MIN6細(xì)胞作為研究對象,選用體內(nèi)FFA含量比例較高的棕櫚酸為代表建立脂環(huán)境,探索脂毒性對胰島β細(xì)胞的損傷作用。通過實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)了棕櫚酸可抑制胰島β細(xì)胞的細(xì)胞活性,并有誘導(dǎo)其凋亡作用。鑒于β細(xì)胞的凋亡及脂毒性在糖尿病病理生理機(jī)制中的重要地位和作用,研究藥物是否具備對抗高脂環(huán)境誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡的作用,即拮抗脂毒性損傷的保護(hù)作用便具有重要意義。因此本實(shí)驗(yàn)著重研究了GLP-1受體激動劑Exend
24、in-4在此方面的作用,通過研究發(fā)現(xiàn)Exendin-4不僅可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞生長,在脂毒性條件下提高細(xì)胞活性,且具備拮抗脂毒性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的作用。同時為了進(jìn)一步明確Exendin-4發(fā)揮如上保護(hù)作用的可能機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)圍繞PI3K/PKB信號通路、ERK1/2信號通路及線粒體途徑展開研究,證實(shí)了該保護(hù)作用涉及如上通路。
脂毒性誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是和肥胖相關(guān)的T2DM的主要機(jī)制之一,減少脂毒性對胰島β細(xì)胞的損傷可
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