GLP-1對(duì)胰島β細(xì)胞脂性凋亡的拮抗作用及機(jī)制初探.pdf

1、目的：利用高濃度棕櫚酸條件下培養(yǎng)的小鼠胰島素瘤細(xì)胞株β—TC3細(xì)胞作為細(xì)胞脂性凋亡模型，觀察游離脂肪酸(FFA)對(duì)胰島β細(xì)胞凋亡的影響及其與PANDER的關(guān)系，并觀察GLP-1對(duì)胰島β細(xì)胞脂性凋亡的干預(yù)作用，以及對(duì)PANDER表達(dá)的影響，探討其可能的拮抗胰島β細(xì)胞脂性凋亡的機(jī)制。 方法：①β—TC3細(xì)胞以PRMI-1640完全培養(yǎng)液、37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)；每3-4天換液1次，約每周傳代1次。按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行分組處理。②分組

2、：β—TC3細(xì)胞分為3組：(1)空白對(duì)照組，(2) PA處理組(0.5mmol/L PA)，(3)PA+GLP-1處理組(0.5mmol/L PA，10nmol/L GLP-1)，培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行檢測。另外以不同濃度的PA處理β—TC3細(xì)胞24小時(shí)后進(jìn)行檢測。③細(xì)胞凋亡的檢測：各組細(xì)胞均分別以MTT法、Annexin—V/PI熒光染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(FACS)、Tunel熒光染色計(jì)數(shù)，定性檢測細(xì)胞凋亡。并以MTT法測定不同濃度PA處理

3、24小時(shí)后的β—TC3細(xì)胞的存活率。④PANDER mRNA表達(dá)：提取細(xì)胞總RNA，純化、定量后，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定各組PANDER mRNA的水平。 結(jié)果：⑴PA對(duì)胰島β細(xì)胞的存活率具有劑量依賴性抑制作用：MTT法測定顯示β細(xì)胞經(jīng)過不同濃度的PA處理后，細(xì)胞存活率下降，并且隨著PA濃度升高，細(xì)胞存活率呈逐漸下降趨勢。相關(guān)分析顯示，細(xì)胞活性與PA濃度呈負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)為—0.844(P<0.05)。當(dāng)PA濃度0.25m

4、mol/L時(shí)，β—TC3細(xì)胞存活率開始出現(xiàn)顯著下降(83.83％±4.08％，vs空白對(duì)照P<0.05)，當(dāng)PA濃度為1.0mmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率更進(jìn)一步下降(63.33％±12.27％，vs空白對(duì)照組P<0.01)。⑵GLP-1拮抗PA引起的胰島β—TC3細(xì)胞存活率下降：設(shè)定空白對(duì)照組的存活率為100.00％±0.00％，MTT法測定顯示PA組的存活率87.01％±6.05％，PA+GLP-1組的存活率98.33％±9.83％。P

5、A組的細(xì)胞存活率明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)，而PA+GLP-1組的細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組無明顯差異(P>0.05)，但顯著高于PA組(P<0.05)。⑶PA對(duì)胰島β—TC3細(xì)胞凋亡的影響以及GLP-1對(duì)其的拮抗：Annexin—V/PI雙標(biāo)流式測定顯示空白對(duì)照組的凋亡率為18.20％±2.14％，PA組的凋亡率為52.73％±3.29％，PA+GLP-1組的凋亡率為34.49％±1.57％，PA組的凋亡率比空白對(duì)照組增高2.5倍

6、(P<0.05)，PA+GLP-1組的凋亡率顯著比PA組低(P<0.05)。Tunel法定性檢測凋亡顯示，PA組的凋亡細(xì)胞數(shù)量比空白對(duì)照組明顯增多，PA+GLP-1組的凋亡細(xì)胞數(shù)量比PA組低。⑷PANDER mRNA表達(dá)水平的變化：采用Delta—delta Ct法計(jì)算各個(gè)樣品F值，并以F值表示mRNA表達(dá)水平，F(xiàn)值越低，說明mRNA表達(dá)水平越高。設(shè)定本實(shí)驗(yàn)空白對(duì)照組的F值為1.00％±0.00％，則PA組的F值為0.16％+0.16％

7、，PA+GLP-1組的F值為2.01％±0.46％，與空白對(duì)照組比較，PA組的F值明顯降低(P<0.05)，PA+GLP-1組的F值比PA組明顯升高(P<0.05)，而與空白對(duì)照組沒有差異。 結(jié)論：①FFA呈劑量依賴性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡，GLP-1具有拮抗FFA致胰島β細(xì)胞凋亡的作用。②FFA在誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡的同時(shí)刺激胰島β細(xì)胞PANDER這一胰島內(nèi)源性致凋亡因子的表達(dá)，GLP-1對(duì)FFA此一作用同樣具有抑制作用。③PAND