GLP-1通過激活Akt通路拮抗FFA誘導的PANDER表達及胰島β細胞凋亡.pdf

1、目的：胰島β細胞凋亡是1型和2型糖尿病共同的發(fā)病基礎，脂毒性被證實是引起胰島β細胞凋亡的重要原因之一，其機制涉及復雜的信號通路和途徑，炎癥因子、細胞因子在其中有重要作用。GLP-1是近年發(fā)現(xiàn)的具有廣泛生物作用的多肽，它能拮抗多種因素誘導的胰島β細胞凋亡，有效保護胰島細胞，Akt/PKB這一影響胰島細胞生長與存活的關鍵激酶及其信號通路是目前較明確的GLP-1作用靶點之一。胰腺衍生因子(pancreatic derived factor,P

2、ANDER)是新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性致凋亡細胞因子，主要在胰島細胞高度表達，研究發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖、促胰島素釋放的刺激物、炎癥因子都可以上調(diào)其表達并引起胰島細胞凋亡。本課題的前期階段發(fā)現(xiàn)游離脂肪酸能刺激胰島βTC3細胞PANDER mRNA的表達，而GLP-1能明顯拮抗胰島細胞脂性凋亡，并同時顯著下調(diào)游離脂肪酸引起的PANDER mRNA的表達，提示PANDER可能是胰島β細胞脂性凋亡中的重要介質，并與GLP-1的抗凋亡作用有關。本課題在以往研

3、究的基礎上，進一步論證PANDER與胰島β細胞脂性凋亡的關系以及PANDER在GLP-1拮抗胰島β細胞脂性凋亡中的作用，并觀察其與Akt信號通道的關系，以明確PANDER與胰島β細胞脂性凋亡及GLP-1拮抗胰島β細胞脂性凋亡是否相關及可能的機制。
　　 方法：(1)不同濃度PA(0.25mM,0.50mM,1.0mM)處理的βTC3細胞12小時，利用Hoechst33258核熒光染色熒光顯微鏡下觀察胰島β細胞凋亡形態(tài)及計算凋亡率

4、。(2)不同濃度PA(0.25mM,0.50mM,1.0mM)處理βTC3細胞12小時及0.5mM的PA處理6、12、24小時后，利用實時熒光定量PCR法檢測PANDER mRNA表達。(3)βTC3細胞按空白對照組、PA組(0.5mmol/L PA)、PA+GLP-1組(0.5mmol/L PA+10nmol/L GLP-1)、GLP-1(10nmol/L GLP-1)分別處理12小時后，以Western Blot法檢測βTC3細胞P

5、ANDER、Akt、pro-caspase3蛋白表達水平。(4)βTC3細胞按空白對照組、PA組(0.5mmol/L PA)、PA+GLP-1組(0.5mmol/LPA+10nmol/L GLP-1)、GLP-1(10nmol/L GLP-1)、PA+Akti-1/2組(0.5mmol/LPA+5umol/L Akti-1/2)、PA+GLP-1+Akti-1/2組(0.5mmol/L PA+10mol/L GLP-1+5umol/L

6、Akti-1/2)、GLP-1+Akti-1/2組(10nmol/L GLP-1+5umol/L Akti-1/2)分別處理12小時后，以Western Blot法檢測βTC3細胞PANDER蛋白表達，Hoechst33258核染色法檢測細胞凋亡情況。
　　 結果：(1)PA能濃度依賴性地誘導βTC3細胞凋亡：Hoechst33258核染色法檢測對照組細胞凋亡率為(5.2±1.7)％，0.25mM、0.50mM及1.0mM的PA

7、處理組βTC3細胞凋亡率分別為(18.4±3.3)％(與對照組相比，P＜0.05)、(35.6±6.7)％(與對照組相比，P＜0.01)、(42.5±5.3)％(與對照組相比，P＜0.01)。(2)PA在誘導βTC3凋亡的同時濃度依賴性及時間依賴性地增加βTC3細胞PANDER mRNA的表達：不同濃度PA(0.25mM,0.50mM,1.0mM)處理βTC3細胞12小時，設定對照組PANDERmRNA表達量為1，0.25mM、0.50

8、mM、1.0mMPA處理組PANDER mRNA的表達量分別是對照組的(1.12±0.21)倍，(1.47±0.17)倍，(1.35±0.16)倍，與對照組相比，0.50mM及1.0mM處理組PANDER mRNA的表達均顯著增加(P＜0.01)；0.50mM的PA分別處理βTC3細胞0、6、12、24小時，PA處理6h、12h、24h后PANDER mRNA的表達量分別是對照組的(1.08±0.17)倍，(1.35±0.11)倍，(2

9、.88±0.45)倍，隨著PA處理時間的延長，PANDERmRNA的表達增加，其中0.50mM處理12小時組與對照組相比P＜0.05，0.50mM處理24小時組與對照組相比P＜0.01。(3)PA增加PANDER蛋白表達的同時，抑制Akt蛋白磷酸化，促進caspase-3激活，GLP-1可以拮抗PA的上述效應：以對照組PANDER蛋白的相對表達為100％，PA組PANDER蛋白相對表達為(148±18)％，較對照組明顯增加(P＜0.05

10、)，PA+GLP-1組PANDER蛋白相對表達為(70±17)％，較PA組明顯下降(P＜0.05)；以對照組p-Akt蛋白的相對表達為100％，PA組p-Akt蛋白相對表達為(63±30)％，PA+GLP-1組p-Akt蛋白相對表達為(99±19)％，PA組p-Akt蛋白表達較對照組明顯降低(P＜0.05)，而PA+GLP-1組p-Akt蛋白表達較PA組明顯升高(P＜0.05)，GLP-1組p-Akt蛋白相對表達為(137±27)％，較

11、對照組明顯升高(P＜0.05)；以對照組pro-capse3蛋白的相對表達為100％，PA組pro-caspase3蛋白相對表達為(54±5)％，PA+GLP-1組pro-caspase3蛋白相對表達為(89±23)％，PA組pro-caspase3蛋白表達較對照組明顯降低(P＜0.05)，即PA激活Caspase-3，而PA+GLP-1組pro-caspase3蛋白表達較PA組升高(P＜0.05)。GLP-1對未經(jīng)PA作用的細胞的PA

12、NDER及Caspase-3無影響，但明顯抑制在PA誘導的凋亡細胞中PANDER過表達和Caspase-3激活。(4)GLP-1拮抗PA致凋亡作用的同時抑制PA誘導的PANDER表達，Akt抑制劑減弱GLP-1的以上效應：以對照組PANDER蛋白的相對表達為100％，PA組PANDER蛋白表達為(202±61)％，PA+Akti-1/2組PANDER蛋白相對表達為(246±60)％，與PA組無明顯差異，但細胞凋亡率較對照組及PA組升高(

13、P＜0.05)；PA+GLP-1+Akti-1/2組PANDER蛋白相對表達為(249±49)％，較PA+GLP-1組(110±54)％顯著升高(P＜0.01)，細胞凋亡率顯著高于PA+GLP-1組(P＜0.01)；GLP-1+Akti-1/2組PANDER蛋白相對表達為(257±86)％，較GLP-1組(131±47)％顯著升高(P＜0.01)，細胞凋亡率亦高于GLP-1組(P＜0.05)。
　　 結論：(1)PANDER與胰