微囊藻毒素LR通過激活A(yù)kt-mTORC1-S6K1通路促進(jìn)肝細(xì)胞增殖.pdf

1、微囊藻毒素(microcystins，MCs)是一組單環(huán)七肽類化合物，由藍(lán)藻的一些種屬產(chǎn)生，在發(fā)生水華時(shí)被大量釋放到水體中，可通過食物鏈進(jìn)入動物及人體內(nèi)進(jìn)而威脅人類的健康。因此，微囊藻毒素的相關(guān)研究近三十年來一直是環(huán)境科學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)的熱點(diǎn)。目前已經(jīng)報(bào)道的微囊藻毒素異構(gòu)體有90多種，其中微囊藻毒素LR(microcystin-LR，MC-LR)是分布最廣和毒性最大的一種，而肝臟是其最主要靶器官。MC-LR可以引發(fā)一系列的肝毒性，包括誘導(dǎo)肝

2、細(xì)胞凋亡、壞死、肝腫大、肝出血和肝衰竭等。流行病學(xué)研究還表明MC-LR是一種促腫瘤因子，與原發(fā)性肝癌的發(fā)生密切相關(guān)。MC-LR發(fā)揮其毒性作用的主要機(jī)制是抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)的活性，因此圍繞MC-LR與PP2A的作用以及由此而產(chǎn)生的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)及病理學(xué)改變是揭示MC-LR致毒機(jī)制的關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)室前期工作發(fā)現(xiàn)暴露MC-LR24 h后，其可以在多種細(xì)胞中積累并抑制PP2A活性，進(jìn)而影響多個(gè)骨架相關(guān)蛋白的磷酸化水平并引起細(xì)胞骨架改變，但

3、多數(shù)細(xì)胞中沒有檢測到MC-LR誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞學(xué)效應(yīng)。
　　目的:PP2A是哺乳動物體內(nèi)最重要的絲/蘇氨酸蛋白磷酸酶，參與多種細(xì)胞活動的調(diào)控，其持續(xù)失活除了導(dǎo)致其有關(guān)底物的改變和相關(guān)信號通路的變化也應(yīng)在細(xì)胞水平有所體現(xiàn)。因此，本研究以既有研究為基礎(chǔ)，改變細(xì)胞暴露MC-LR的時(shí)間，進(jìn)一步研究MC-LR對PP2A的影響，并以此探討MC-LR引發(fā)的細(xì)胞效應(yīng)及相關(guān)機(jī)制。在此基礎(chǔ)上，用動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的發(fā)現(xiàn)。
　　方法:以人肝細(xì)胞

4、系HL7702為研究對象，暴露于1-10μM的MC-LR1-72 h，研究PP2A活性變化規(guī)律及相關(guān)機(jī)制，測定細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期等細(xì)胞學(xué)效應(yīng)，對發(fā)生改變的細(xì)胞效應(yīng)相關(guān)信號通路進(jìn)行檢測以探討其機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)小鼠實(shí)驗(yàn)，暴露20-80μg/kg的MC-LR2 h-4 d，對相關(guān)的變化進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　結(jié)果:1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
　　(1) MC-LR在1h內(nèi)迅速在HL7702細(xì)胞內(nèi)積累并結(jié)合到PP2A/C亞基

5、上，其結(jié)合量不隨暴露時(shí)間的延長而增加。
　　(2) MC-LR對PP2A酶活性的抑制呈濃度依賴性，在染毒24-72 h之間，PP2A相對活性保持在一定水平。
　　(3) MC-LR誘導(dǎo)PP2A活性調(diào)節(jié)蛋白α4釋放與其結(jié)合的PP2A/C亞基。
　　(4) MC-LR暴露36h后可檢測到其促進(jìn)HL7702細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
　　(5) MC-LR暴露直至48 h對HL7702細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期沒有明顯影響。

6、>　　(6) MC-LR暴露1h開始激活HL7702細(xì)胞內(nèi)Akt/mTORC1/S6K1通路，其中上游Akt的激活與PP2A活性的抑制共同參與MC-LR對S6K1的激活。
　　(7)當(dāng)Akt/mTORC1/S6K1通路被抑制后，MC-LR誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖消失。
　　(8) MC-LR暴露1h開始誘導(dǎo)HL7702細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bad磷酸化水平升高。
　　(9) MC-LR暴露1h開始激活HL7702細(xì)胞內(nèi)周期蛋白依賴性

7、激酶Cdk1。
　　2.動物實(shí)驗(yàn)
　　(1) MC-LR暴露2h內(nèi)在小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)明顯積累并結(jié)合到PP2A/C上，結(jié)合量不隨暴露時(shí)間的延長而增加。
　　(2) MC-LR對小鼠肝臟內(nèi)PP2A活性的抑制與暴露濃度和時(shí)間相關(guān)。
　　(3) MC-LR暴露誘導(dǎo)了小鼠肝臟PP2A活性調(diào)節(jié)蛋白α4釋放其結(jié)合的PP2A/C。
　　(4) MC-LR誘導(dǎo)小鼠肝臟細(xì)胞增殖。
　　(5) MC-LR激活小鼠肝臟細(xì)胞內(nèi)A

8、kt/mTORC1/S6K1及Akt/β-catenin信號通路。
　　(6)本實(shí)驗(yàn)室前期研究已證實(shí)了MC-LR對HL7702細(xì)胞中ERK/JNK/p38通路的激活，本研究發(fā)現(xiàn)MC-LR也激活了小鼠肝臟中ERK/JNK/p38及其下游轉(zhuǎn)錄因子。
　　結(jié)論:本研究用離體和活體實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式證明了:
　　1.MC-LR可以在短時(shí)間內(nèi)在肝細(xì)胞內(nèi)達(dá)到最大程度積累并結(jié)合到PP2A/C上，進(jìn)而造成PP2A活性呈濃度和時(shí)間依賴性抑

9、制。
　　2.PP2A活性調(diào)節(jié)蛋白α4通過釋放其結(jié)合的PP2A/C亞基在一定程度上減緩了MC-LR對PP2A活性抑制的程度。
　　3.MC-LR能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞過度增殖，其分子機(jī)制是MC-LR抑制PP2A活性導(dǎo)致的Akt/mTORC1/S6K1通路的激活。另外，Akt/β-catenin和ERK/JNK/p38 MAPK可能也參與了這一過程。
　　4.MC-LR引起的PP2A活性抑制雖然也引起了凋亡相關(guān)蛋白和周期相關(guān)蛋白