GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)高糖所致心肌細(xì)胞凋亡抑制作用的研究.pdf

1、目的:
　　心血管疾病作為主要的糖尿病(DM)并發(fā)癥，是DM患者的主要死因。以往研究主要關(guān)注大血管病變導(dǎo)致的冠心病，而對(duì)于微血管病變、自主神經(jīng)病變和心肌代謝異常等引起的DM心肌病(DCM)研究較少。近年的研究表明，DCM與DM患者心血管疾病的高發(fā)病率和高死亡率密切相關(guān)。心肌細(xì)胞凋亡是DCM的主要病變，是導(dǎo)致DM患者心衰的主要原因。而高糖是導(dǎo)致DM心肌細(xì)胞凋亡的核心機(jī)制之一。胰高糖素樣肽1受體激動(dòng)劑(GLP-1RA)作為新一代降糖藥

2、，具有多器官效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)GLP-1具有抗心肌細(xì)胞凋亡的作用，但其內(nèi)在機(jī)制尚不完全清楚。作為一種G蛋白耦聯(lián)受體，GLP-1R激活后使環(huán)一磷酸腺苷(cAMP)升高。研究表明，cAMP既是促調(diào)亡信使，又是抗凋亡信使，其促調(diào)亡作用多與蛋白激酶A(PKA)有關(guān)，而抗凋亡作用多與cAMP激活的交換蛋白(Epac)有關(guān)。GLP-1RA能否通過(guò)激活Epac信號(hào)通路發(fā)揮心肌保護(hù)作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬探討GLP-1RA利拉魯肽是否通過(guò)激活Epac-

3、1和存活蛋白Akt抑制高糖所致心肌細(xì)胞凋亡，從而為GLP-1RA在DCM預(yù)防和治療中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，分為正糖組（NG組）、高糖組（HG組）、高糖+利拉魯肽干預(yù)組（Lir1組:100nM利拉魯肽干預(yù)1.5小時(shí);Lir2組:200nM利拉魯肽干預(yù)1.5小時(shí);Lir3組:100nM利拉魯肽干預(yù)3小時(shí);Lir4組:200nM利拉魯肽干預(yù)3小時(shí)），用末端脫氧核苷酰基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)性dUTP切

4、口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))，用DCFH-DA探針檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)，并用熒光酶標(biāo)儀定量分析。用Western Blotting方法檢測(cè)Epac-1、Akt、P-AktSer473、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)變化。
　　2.為驗(yàn)證Epac-1激活與Akt激活之間的關(guān)系，①用不同劑量特異性Epac-1激活劑8CPT-2Me-cAMP（CPT1組:50uM;C

5、PT2組:100uM;CPT3組:150uM）對(duì)高糖環(huán)境下心肌細(xì)胞干預(yù)8分鐘，②用篩選出的2號(hào)和3號(hào)Epac-1shRNA轉(zhuǎn)染高糖培養(yǎng)基中的心肌細(xì)胞（SH21組:sh2轉(zhuǎn)染24小時(shí);SH22組:sh2轉(zhuǎn)染48小時(shí);SH31組:sh3轉(zhuǎn)染24小時(shí);SH32組:sh3轉(zhuǎn)染48小時(shí)），然后給予200nM利拉魯肽干預(yù)3小時(shí)后提取蛋白，用Western Blotting方法檢測(cè)Epac-1，Akt，P-AktSer473的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)

6、果:
　　1.TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞變小，呈短梭形或圓形，核固縮，呈棕黑色。利拉魯肽顯示出隨劑量增加和時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)的抗凋亡作用。HG組AI較NG組升高(P＜0.01)，與HG組相比，Lir1組未能明顯降低AI，Lir2組明顯降低了AI(P＜0.05)，Lir3組和Lir4組則更明顯地降低了AI(P＜0.01)。從分子生物學(xué)角度評(píng)價(jià)凋亡，HG組較NG組Bcl-2/Bax比值降低(P＜0.01)，利拉魯肽干預(yù)使Bcl-2/Bax比值升

7、高，尤以Lir2組最為明顯(P＜0.01)，Lir1、Lir3組(P＜0.01)和Lir4組(P＜0.05)次之。
　　2.HG組較NG組細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增加（P＜0.01），利拉魯肽表現(xiàn)出隨劑量增加和時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增強(qiáng)的抗氧化作用，Lir1組細(xì)胞內(nèi)ROS較HG組有所減少，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Lir2、Lir3和Lir4組細(xì)胞內(nèi)ROS較HG組明顯減少(P＜0.01)。熒光顯微鏡下所見(jiàn)與熒光酶標(biāo)儀定量結(jié)果一致。
　　3.HG組較

8、NG組Epac-1表達(dá)明顯減少(P＜0.01)，P-AktSer473/Akt明顯降低(P＜0.05)。與HG組相比，所有Lir組Epac-1表達(dá)明顯增加(P＜0.01)，Lir1組和Lir3組P-AktSer473/Akt比例明顯升高(P＜0.05)，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與HG組相比，所有CPT組Epac-1表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，CPT1組P-AktSer473/Akt比例升高(P＜0.05)，CPT2組和CPT3組P-Akt

9、Ser473/Akt比例升高更明顯(P＜0.01)。與Lir組相比，SH21和SH31組Epac-1表達(dá)減少(P＜0.05)，SH22和SH32組Epac-1表達(dá)減少更明顯(P＜0.01)，所有Epac-1shRNA轉(zhuǎn)染組P-AktSer473/Akt明顯減少(P＜0.05)。P-AktSer473/Akt比例變化趨勢(shì)與Epac-1表達(dá)變化趨勢(shì)一致。
　　結(jié)論:
　　1.高糖抑制H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)Epac-1表達(dá)和Akt活化