GLP-1受體激動劑Exendin-4改善老齡大鼠骨質(zhì)疏松作用機理的研究.pdf

1、目的:
　　骨質(zhì)疏松是老年人的常見病和多發(fā)病,全球50歲以上的人群中,1/3的女性和1/5的男性患有骨質(zhì)疏松。骨質(zhì)疏松最常見和最嚴重的并發(fā)癥是各種類型的骨折,美國每年因骨質(zhì)疏松發(fā)生骨折的人數(shù)超過心肌梗死和腦卒中的總和,其中髖部骨折的死亡率為24％,危害性不容忽視。隨著人口老齡化形勢日趨嚴峻,骨質(zhì)疏松已成為嚴重危害人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。骨質(zhì)疏松的基本病理機制是骨重建過程中成骨細胞骨形成和破骨細胞骨吸收的穩(wěn)態(tài)失衡,骨吸收量大于

2、骨形成量,進而引起骨量減少,骨脆性增加,易發(fā)生骨折。目前臨床治療骨質(zhì)疏松的藥物絕大多數(shù)是作用于破骨細胞,這類藥物通過抑制破骨細胞骨吸收作用延緩骨量丟失,對于已經(jīng)丟失的骨組織無作用,既不能恢復骨量和骨質(zhì)結(jié)構(gòu),也不能促進新骨形成。因此,探索和研制促進骨形成的新藥物,是當前防治骨質(zhì)疏松藥物研發(fā)領(lǐng)域的研究熱點
　　胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一種重要的腸道內(nèi)分泌激素。我們在前期研究中發(fā)

3、現(xiàn),應用 GLP-1受體激動劑 Exendin-4后,能夠顯著改善去卵巢(OVX)所致大鼠骨質(zhì)疏松。但是,在成骨細胞和破骨細胞上均未發(fā)現(xiàn) GLP-1受體,提示 GLP-1可能通過間接機制發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。鑒于成骨細胞由骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)分化而來,BMSCs上有 GLP-1受體,據(jù)此我們提出假說: GLP-1可能通過與 BMSCs表面的GLP-1受體結(jié)合,促進 BMSCs向成骨細胞分化,繼而促進骨形成,改善骨質(zhì)疏松。為證實此

4、假說,本課題擬在離體和整體水平展開 GLP-1受體調(diào)控 BMSCs向成骨細胞分化的作用、分子調(diào)控機制和應用 GLP-1受體激動劑改善老齡大鼠骨質(zhì)疏松療效的研究。
　　方法:
　　1.大鼠骨生物力學和形態(tài)計量學指標的檢測:選取4月齡、12月齡、20月齡自然增齡的SD雄性大鼠作為實驗對象,通過腹腔注射GLP-1受體激動劑Exendin-4(5μg/kg/d)進行治療,給藥12周后,取左側(cè)股骨采用Micro-CT進行骨組織形態(tài)計量

5、學分析,觀察骨密度(BMD)和骨小梁微結(jié)構(gòu)的變化;取右側(cè)股骨采用三點彎曲試驗進行骨生物力學測試;取雙側(cè)脛骨分別進行硬組織切片及脫鈣處理后切片,硬組織切片通過鈣黃綠素和四環(huán)素雙熒光標記分析新骨形成速度,脫鈣后的骨組織切片進行HE染色和甲苯胺藍染色分析骨髓成骨細胞和脂肪細胞數(shù)量。
　　2.大鼠骨代謝相關(guān)生化指標的檢測:大鼠處死前置于代謝籠中,禁食但自由飲水,收集24 h尿液,離心后取上清;收集尿液后處死動物,通過腹主動脈采血5 ml,

6、離心后取血清。全自動生化分析儀測定血清Ca、P及尿液Ca、P的水平;ELISA試劑盒檢測血清中骨特異性堿性磷酸酶(BAP)和骨鈣素(OCN)的含量。
　　3.BMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定:選取3周齡的SD大鼠,脫頸處死后取雙側(cè)股骨及脛骨,剪去兩端骨骺,用α-MEM培養(yǎng)液反復沖洗骨髓腔,制成細胞懸液。細胞懸液離心后棄上清,加入含10%FBS和雙抗的α-MEM培養(yǎng)液反復吹打,直至成為均勻的細胞懸液,接種于培養(yǎng)瓶中;每3d換液一次;傳代培

7、養(yǎng)至第三代細胞,采用流式細胞儀檢測細胞表面抗原 CD29、CD45;分別進行成骨和成脂誘導培養(yǎng),觀察BMSCs向成骨細胞及脂肪細胞分化的能力。
　　4.GLP-1受體表達分析:分離培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)鑒定后,采用GLP-1受體抗體和Hoechst抗體進行免疫熒光雙標分析,通過激光共聚焦顯微鏡觀察 GLP-1受體在BMSCs的表達情況;再通過RT-PCR及Western blot方法檢測BMSCs上GLP-1受體的基因和蛋白表達水平。

8、
　　5.Exendin-4對BMSCs增殖及分化的影響:向BMSCs培養(yǎng)板中分別加入10-9、10-8、10-7 M濃度的Exendin-4,48 h后,采用MTT進行細胞增殖分析;采用成骨誘導培養(yǎng)液(含10%FBS、10mMβ-甘油磷酸鈉、10nM地塞米松,50μg/L維生素C的α-MEM)誘導培養(yǎng)BMSCs,培養(yǎng)21 d后對鈣化結(jié)節(jié)進行茜素紅染色,采用RT-PCR方法檢測成骨相關(guān)基因Runx-2和Oc的表達,觀察Exendi

9、n-4對BMSCs成骨分化的影響;采用成脂誘導培養(yǎng)液(含10%FBS、5μg/ml胰島素、1μM地塞米松、0.5mM IBMX、100μM吲哚美辛的α-MEM)誘導培養(yǎng)BMSCs,培養(yǎng)17 d后,對細胞內(nèi)形成的脂滴進行油紅O染色,采用RT-PCR方法檢測成脂相關(guān)基因Pparγ和C/ebpα的表達,觀察Exendin-4對BMSCs成脂分化的影響。
　　6.BMSCs分化相關(guān)信號分子的檢測:向BMSCs培養(yǎng)板中加入濃度為10-8 M

10、的Exendin-4處理,采用Western blot方法檢測處理0 h、1h、2h、4h、8h、24h后不同時間點的胞漿及胞核中β-catenin的表達;構(gòu)建GLP-1R-shRNA慢病毒表達載體轉(zhuǎn)染BMSCs,沉默GLP-1受體基因的表達,然后用Exendin-4處理細胞,檢測細胞內(nèi)PKA、胞核內(nèi)β-catenin的表達,同時應用腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin、PKA抑制劑H-89、GLP-1R拮抗劑Ex(9-39)對GLP-

11、1受體激動劑成骨誘導分化過程中的BMSCs給予干預后,分別檢測細胞內(nèi)PKA和細胞核內(nèi)β-catenin的表達水平。
　　結(jié)果:
　　1.Exendin-4能夠改善老齡大鼠骨質(zhì)疏松:Micro-CT分析結(jié)果顯示,老齡組大鼠(20月齡)與青年組大鼠(4月齡)相比,骨密度顯著降低,骨小梁微結(jié)構(gòu)破壞嚴重,應用 GLP-1受體激動劑 Exendin-4可以顯著增強骨密度,改善骨小梁微結(jié)構(gòu)的破壞;三點彎曲試驗結(jié)果顯示,Exendin-4

12、能夠顯著改善老齡組大鼠股骨的生物力學特性,增強股骨的機械強度;生化分析結(jié)果表明,Exendin-4可以顯著減少老齡組大鼠尿液中鈣磷流失,升高血清中BAP和OCN水平,提示Exendin-4抑制破骨細胞活動的同時可能促進了成骨細胞活性;骨組織形態(tài)學分析結(jié)果表明,Exendin-4可以提高老齡組大鼠 BFR和MAR,能夠增加骨髓中成骨細胞數(shù)量,減少骨髓中脂肪細胞數(shù)量,具有促進骨形成的作用。
　　2.Exendin-4促進 BMSCs增

13、殖以及向成骨細胞分化,抑制向脂肪細胞分化:RT-PCR、Western Blot和免疫熒光的檢測結(jié)果均證實BMSCs上確實有GLP-1R表達。MTT實驗結(jié)果顯示,GLP-1和Exendin-4可以濃度依賴性促進BMSCs增殖。在成骨誘導培養(yǎng)條件下,Exendin-4可以促進成骨分化標志基因Runx-2和Bglap的表達,使成骨過程中的礦化結(jié)節(jié)增多,骨形成功能增強。在成脂誘導條件下,Exendin-4可以抑制成脂分化標志基因Pparγ和C

14、/ebpα的表達,使成脂過程中細胞內(nèi)脂滴生成減少,抑制脂肪細胞形成。
　　3.Exendin-4調(diào)控BMSCs分化的作用及分子機制:隨著給予Exendin-4處理時間的延長,胞漿中β-catenin的表達逐漸減少,胞核內(nèi)β-catenin的表達逐漸增加,表明Exendin-4可以促進β-catenin轉(zhuǎn)位入核。給予腺苷酸環(huán)化酶激活劑Forskolin后,細胞內(nèi)PKA和胞核內(nèi)β-catenin的表達水平升高;給予PKA抑制劑H-89

15、或GLP-1R拮抗劑Ex(9-39)后,細胞內(nèi)PKA和胞核β-catenin的表達水平降低;沉默GLP-1受體基因的表達可明顯降低細胞內(nèi)PKA和胞核內(nèi)β-catenin的表達水平。上述結(jié)果表明,GLP-1受體激動劑Exendin-4可能通過活化PKA激活BMSCs上的Wnt信號通路,進而引起β-catenin轉(zhuǎn)位入核,激活成骨分化相關(guān)基因的表達,促進 BMSCs向成骨細胞分化。
　　結(jié)論:
　　1.GLP-1受體激動劑Exe