GLP-1受體非肽類(lèi)激動(dòng)劑鎮(zhèn)痛作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、慢性疼痛是指疼痛持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，超過(guò)受傷愈合的時(shí)間而與引起持續(xù)疼痛的慢性病理過(guò)程有關(guān)，或經(jīng)數(shù)月或數(shù)年疼痛復(fù)發(fā)。根據(jù)發(fā)生的原因不同，慢性疼痛可分為免疫炎癥痛、神經(jīng)病理性痛、癌癥痛、糖尿病性神經(jīng)痛、帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛、艾滋病相關(guān)神經(jīng)痛和腰背痛等。慢性疼痛是臨床上最常見(jiàn)的癥狀之一，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前臨床上治療慢性疼痛主要包括阿片類(lèi)藥,局部麻醉藥如利多卡因，三環(huán)抗抑郁藥如阿米替林和抗癲癇藥如加巴噴丁和普瑞巴林。但是由于對(duì)慢性疼痛較低的認(rèn)

2、知度，市場(chǎng)上現(xiàn)有的多數(shù)產(chǎn)品對(duì)于慢性疼痛的治療針對(duì)性較低，或給藥不方便，對(duì)大部分患者無(wú)效或只能有限地緩解疼痛，同時(shí)可能引起許多不良反應(yīng)包括嗎啡鎮(zhèn)痛耐受性。因此，發(fā)現(xiàn)安全有效、無(wú)耐受成癮性的新型治療慢性疼痛藥物和新靶點(diǎn)分子及其信號(hào)通路，是當(dāng)前神經(jīng)生物學(xué)和新藥研究熱點(diǎn)。
　　GLP-1受體是由463個(gè)氨基酸組成的跨膜蛋白，屬于蛋白質(zhì)家族B/G蛋白偶聯(lián)受體。它具有調(diào)節(jié)內(nèi)源性的GLP-1和胃泌酸調(diào)節(jié)素合成和分泌的作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期工作首次

3、發(fā)現(xiàn)脊髓和皮下給予GLP-1受體肽類(lèi)激動(dòng)劑GLP-1和艾塞那肽能夠劑量依賴(lài)式地抑制福爾馬林誘導(dǎo)的II相疼痛、腫瘤疼痛、神經(jīng)源性疼痛和糖尿病疼痛，而不影響急性疼痛。我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，激動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞上的GLP-1受體，導(dǎo)致鎮(zhèn)痛遞質(zhì)β-內(nèi)啡肽釋放產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用。我們實(shí)驗(yàn)室從而提出假說(shuō)，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞GLP-1受體/β-內(nèi)啡肽是一條新的鎮(zhèn)痛靶點(diǎn)通路。
　　采用化學(xué)結(jié)構(gòu)與GLP-1和艾塞那肽不同尤其是非肽類(lèi)GLP-1受體激動(dòng)劑，有助于進(jìn)一

4、步證實(shí)脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞GLP-1受體/β-內(nèi)啡肽鎮(zhèn)痛通路假說(shuō)。GLP-1和艾塞那肽是肽類(lèi)大分子藥物(分子量約為3000-4000 Da)，難以穿過(guò)血腦屏障，應(yīng)用受到限制。GLP-1受體非肽類(lèi)激動(dòng)劑具有分子量小，可能可以口服，跨越血腦屏障等優(yōu)點(diǎn)，更具有潛力開(kāi)發(fā)成為臨床應(yīng)用的鎮(zhèn)痛藥物。
　　WB4-24為GLP-1受體激動(dòng)劑Boc5的衍生物，分子量約1000 Da，可能是目前最有效的非肽類(lèi)正構(gòu)型GLP-1受體激動(dòng)劑(活性約在0.2μM)

5、，并具有顯著的降低血糖、體重和飲食作用。藏藥獨(dú)一味水提物及其有效成分山梔苷子甲酯(環(huán)烯醚萜苷類(lèi)化合物)可以抑制福爾馬林疼痛，神經(jīng)源性疼痛和骨癌痛，且其鎮(zhèn)痛作用可被exendin9-39所拮抗。山梔苷子甲酯分子量約300 Da左右，一倍證明為GLP-1受體正構(gòu)型激動(dòng)劑。據(jù)此，我們?cè)诒菊n題中研究WB4-24和山梔子苷甲酯鎮(zhèn)痛作用及其作用機(jī)制。我們首先探討GLP-1受體非肽類(lèi)激動(dòng)劑WB4-24對(duì)炎性疼痛的鎮(zhèn)痛作用，觀(guān)察給予WB4-24后對(duì)模型

6、動(dòng)物的熱輻射痛和機(jī)械性疼痛的影響，并深入研究WB4-24通過(guò)激動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞中的GLP-1受體，對(duì)β-內(nèi)啡肽的釋放和炎性因子釋放的影響。我們接著探討山梔子苷甲酯對(duì)神經(jīng)源性疼痛的鎮(zhèn)痛作用，觀(guān)察山梔子苷甲酯對(duì)神經(jīng)源性疼痛模型動(dòng)物的機(jī)械性疼痛的影響，并深入研究其鎮(zhèn)痛作用機(jī)制是否與激動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和釋放β-內(nèi)啡肽相關(guān)，并進(jìn)一步探討了山梔子苷甲酯自身鎮(zhèn)痛耐受和對(duì)嗎啡交叉耐受。
　　動(dòng)物模型選用福爾馬林，角叉菜膠和完全

7、弗氏佐劑(CFA)引起的急性或慢性炎性疼痛模型和神經(jīng)源性疼痛模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模成功后，應(yīng)用熱輻射痛儀或機(jī)械痛測(cè)痛儀測(cè)量疼痛模型的熱輻射痛或機(jī)械性疼痛。同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR或熒光免疫試劑盒測(cè)定β-內(nèi)啡肽在細(xì)胞上清液或和組織中的表達(dá)量和釋放量，炎性因子的釋放也應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行測(cè)定。原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，應(yīng)用了改進(jìn)的小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分離的技術(shù)。
　　在小膠質(zhì)細(xì)胞配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，WB4-24與exendin(9-39

8、)-FITC表現(xiàn)出特異性地競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，在表達(dá)人GLP-1受體的HEK293細(xì)胞和表達(dá)大鼠GLP-1受體的PC12細(xì)胞中，WB4-24可以劑量依賴(lài)式地使GLP-1-FITC量效曲線(xiàn)右移。鞘內(nèi)注射WB4-24(0.3，1，3，10，30和100μg)，劑量依賴(lài)式對(duì)福爾馬林，角叉菜膠，和完全弗氏佐劑(CFA)引起的急性或慢性炎性疼痛表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛作用，疼痛抑制率大約為60-80％。但鞘內(nèi)注射WB4-24對(duì)福爾馬林疼痛急性期卻沒(méi)有影響。皮下注

9、射WB4-24同樣對(duì)完全弗氏佐劑(CFA)引起的炎性疼痛具有良好鎮(zhèn)痛作用，熱輻射痛和機(jī)械性疼痛的鎮(zhèn)痛效率分別為52.6%和48.6%。WB4-24激動(dòng)GLP-1受體引起小膠質(zhì)細(xì)胞β-內(nèi)啡肽釋放，其β-內(nèi)啡肽釋放作用可以完全被小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素所拮抗，但WB4-24可以通過(guò)激動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞 GLP-1受體對(duì)炎性疼痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，卻對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子的釋放沒(méi)有影響。另一方面，鞘內(nèi)注射山梔子苷甲酯(SM)對(duì)神經(jīng)源性疼痛也可以產(chǎn)生劑量依賴(lài)

10、式的鎮(zhèn)痛作用，ED50為40.0μg，最高抑制率為48.8%。WB4-24和山梔子苷甲酯的鎮(zhèn)痛作用均可以完全被小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑米諾環(huán)素，β-內(nèi)啡肽抗血清，μ-阿片受體拮抗劑CTAP拮抗，但不能被κ-阿片受體拮抗劑nor-BNI和δ-阿片受體拮抗劑那曲吲哚所拮抗。此外，山梔子苷甲酯也可以激動(dòng)小膠質(zhì)細(xì)胞，使小膠質(zhì)細(xì)胞釋放β-內(nèi)啡肽量升高，山梔子苷甲酯的鎮(zhèn)痛作用和刺激β-內(nèi)啡肽的釋放作用完全被p38MAPK抑制劑SB203580而不能被JNK

11、抑制劑SP600125和ERK抑制劑U0126所拮抗。在鎮(zhèn)痛耐受實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)7天給予山梔子苷甲酯不引起自身鎮(zhèn)痛耐受，與嗎啡合用亦不產(chǎn)生交叉鎮(zhèn)痛耐受。
　　上述結(jié)果證實(shí)了GLP-1受體非肽類(lèi)激動(dòng)劑 WB4-24和山梔子苷甲酯對(duì)福爾馬林，角叉菜膠，和完全弗氏佐劑(CFA)引起的急性或慢性炎癥疼痛和神經(jīng)源性疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，并且長(zhǎng)期連續(xù)給予山梔子苷甲酯可以抑制神經(jīng)源性疼痛，既不會(huì)產(chǎn)生自身耐受也不會(huì)產(chǎn)生嗎啡交叉耐受，WB4-24和山