脂毒性對胰島微血管內(nèi)皮和胰島功能的損傷及GLP-1的干預(yù)作用.pdf

1、研究背景和目的：
　　 2009年我國城市人口中成年人糖尿病發(fā)病率已達(dá)9.7％，由此推測中國糖尿病患者人數(shù)已達(dá)9240萬，防治工作十分艱巨。而其中90％以上的患者屬于2型糖尿病。2型糖尿病發(fā)病的主要機(jī)制是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能受損，而后者是2型糖尿病發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。造成胰島β細(xì)胞功能受損的病理機(jī)制，主要是脂毒性和糖毒性。隨著中國人群日常飲食結(jié)構(gòu)的變化，大量脂類食物的攝入，脂質(zhì)代謝過剩引起的脂毒性的損傷在2型糖尿病的病理進(jìn)展中

2、起了決定性的作用。
　　 脂毒性是指過量的脂質(zhì)在多個(gè)臟器和組織異位沉積并導(dǎo)致其功能損害。糖代謝紊亂常伴有顯著的脂代謝紊亂，升高的低密度脂蛋白和糖尿病常同時(shí)出現(xiàn)。研究證實(shí)，2型糖尿病的發(fā)病與糖代謝和脂代謝紊亂有關(guān)，升高的甘油三酯，低密度脂蛋白及降低的高密度脂蛋白與高血糖的類型顯著相關(guān)。
　　 而在脂質(zhì)代謝中，氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)是一種重要的代謝性損傷致病因素，在體內(nèi)它是由低密度脂蛋白進(jìn)入血管壁后被內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬

3、細(xì)胞等生成的氧自由基及酶類氧化而成，可通過多種效應(yīng)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。Ox-LDL的細(xì)胞毒性引起大量活性氧自由基(ROS)的產(chǎn)生，引起DNA鏈斷裂、損傷。然而，關(guān)于Ox-LDL對胰島的微血管內(nèi)皮引起的損傷的機(jī)制研究還未見報(bào)道。在2型糖尿病中，胰島微循環(huán)的損傷可能進(jìn)一步加重了胰島β細(xì)胞團(tuán)的損失。
　　 胰島是高度血管化的組織，具有獨(dú)特的微血管系統(tǒng)，不僅保證了胰島的血供，而且影響著胰島激素的合成、分泌功能。其體積僅占胰腺總體積的

4、1％～2％，但與胰腺外分泌組織相比，其毛細(xì)血管密度增加了近5倍，血流量占整個(gè)胰腺血流量的10％～20％。豐富的血供不僅滿足胰島對氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的需要，而且使胰島能夠迅速感知體內(nèi)代謝環(huán)境的變化，以便分泌各種激素來調(diào)節(jié)機(jī)體代謝平衡。胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Islet microvascular endothelial cells，IMECs)是胰島微血管的主要組分，覆襯于胰島微血管內(nèi)壁，內(nèi)皮細(xì)胞不僅向胰島細(xì)胞供應(yīng)氧和營養(yǎng)物質(zhì)，而且在胰島發(fā)育的進(jìn)

5、程中，誘導(dǎo)胰島素相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)β細(xì)胞增殖并維持其分泌功能。
　　 各種代謝應(yīng)激因素極易引起細(xì)胞DNA的損傷。其中聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase，PARP]為一類DNA修復(fù)酶，存在于除酵母外的幾乎所有真核生物的細(xì)胞中，對細(xì)胞的生存、凋亡有重要作用。正常情況下PARP-1的活性很低，PARP-1的活性在DNA損傷時(shí)迅速提高，催化受體蛋白的聚ADP核糖基化反應(yīng)，參與DNA的修復(fù)。另

6、一方面氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的PARP-1過度激活，導(dǎo)致快速消耗NAD+，進(jìn)而消耗ATP，造成細(xì)胞功能失調(diào)和壞死。此外，PARP-1還是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。已經(jīng)在iNOS啟動(dòng)子-859至-850的位置發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子PARP-1的結(jié)合位點(diǎn)，并發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可以促進(jìn)PARP-1的過度表達(dá)且其和iNOS啟動(dòng)子的結(jié)合增加。初步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:氧化應(yīng)激可通過PARP-1來調(diào)節(jié)iNOS的活性，從而來影響血管內(nèi)NO合成，引發(fā)一系列的血管功能障礙疾病的發(fā)生。少量的

7、NO是一個(gè)重要的信使分子，而過量的NO可以進(jìn)一步氧化生成過氧化亞硝酸鹽產(chǎn)物，是強(qiáng)烈的致DNA損傷產(chǎn)物。
　　 胰高糖素肽-1（GLP-1）是由腸L細(xì)胞產(chǎn)生的目前已知作用最強(qiáng)的腸促胰島素分泌肽。進(jìn)餐所致高血糖及營養(yǎng)物質(zhì)的作用促使腸GLP-1分泌，此激素刺激胰島β細(xì)胞分泌胰島素，自1986年諾克(Nauck)等觀察到腸促胰素效應(yīng)以來，越來越多的研究提示，GLP-1不僅作用于胰腺、肝臟、外周組織，參與血糖調(diào)節(jié)，還可能作用于中樞、胃腸道

8、、心血管系統(tǒng)等，發(fā)揮調(diào)節(jié)食欲、血壓、血脂，改善心功能、內(nèi)皮功能等作用。GLP-1促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖，抑制胰島細(xì)胞凋亡的作用已有眾多報(bào)道，但它是否對胰島微循環(huán)系統(tǒng)也能發(fā)揮保護(hù)作用，對糖尿病病程進(jìn)展中的淋巴細(xì)胞浸潤、結(jié)構(gòu)破壞是否也有影響，尚有待我們進(jìn)一步研究。
　　 C57BL/6鼠系經(jīng)長期高脂喂養(yǎng)雖可產(chǎn)生胰島素抵抗(IR)，但還不能產(chǎn)生明顯的高血糖、高膽固醇血癥以及廣泛的胰島破壞，這與人類T2DM的臨床特征尚有一定差距。ApoE-/

9、-C57BL/6鼠系具有脂代謝紊亂和致動(dòng)脈硬化的遺傳背景。當(dāng)以長期高脂飼養(yǎng)時(shí)，ApoE-/-小鼠空腹血糖升高，胰島功能受損。因此在這項(xiàng)研究中，我們采用ApoE-/-小鼠作為基本動(dòng)物模型，給予高脂飲食，建立脂毒性胰島功能損傷模型。
　　 本課題擬圍繞GLP-1在干預(yù)脂毒性損傷胰島微血管和胰島功能中的應(yīng)用開展研究，研究目的包括:1.建立脂毒性胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，探索GLP-1通過PARP-1/iNOS/NO的調(diào)節(jié)通路對胰島微

10、血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響。2.PLVX-AcGFP-N1-PARP-1慢病毒載體的構(gòu)建及在MS-1細(xì)胞中的表達(dá)，為在動(dòng)物模型中過表達(dá)PAPR-1奠定基礎(chǔ)。3.建立高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠胰島損傷模型，進(jìn)一步驗(yàn)證GLP-1通過PARP-1途徑對胰島功能的影響。
　　 研究方法：
　　 第一部分:GLP-1通過PARP-1/iNOS/NO途徑保護(hù)胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞
　　 利用不同濃度及作用時(shí)間的Ox-LDL作用于MS-

11、1細(xì)胞（小鼠胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞系）構(gòu)建胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷模型。應(yīng)用MTT比色法檢測Ox-LDL對MS-1活力的影響，應(yīng)用RealtimeRT-PCR和細(xì)胞免疫熒光染色檢測PARP-1、iNOS的表達(dá)分布，應(yīng)用RealtimeRT-PCR和WesternBloy檢測GLP-1及GLP-1R對Ox-LDL誘導(dǎo)的PARP-1/iNOSmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響，應(yīng)用TUNEL法檢測Ox-LDL致MS-1細(xì)胞凋亡作用。
　　 第

12、二部分:PLVX-AcGFP-N1-PARP-1慢病毒載體的構(gòu)建及在MS-1細(xì)胞中的表達(dá)
　　 從人單核細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA,通過PCR反應(yīng)得到PARP-1的目的片段，將目的片段與pGEM-T-Easy載體連接，所得質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定、測序，將酶切好的帶有粘性末端的PARP-1目的片段定向克隆到PLVX-AcGFP-N1真核表達(dá)載體，再將制備的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。按照Clonetech慢病毒包裝試劑盒說明把PL

13、VX-AcGFP-N1-PARP-1包裝入293FT細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀測293FT細(xì)胞內(nèi)的GFP熒光表達(dá)來觀察慢病毒載體的轉(zhuǎn)染情況。
　　 MS-1細(xì)胞共分三組，分別是慢病毒PARP-1組、空載體組（陽性對照組）、空白組（陰性對照組）。熒光顯微鏡下觀察其轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR檢測PARP-1mRNA的表達(dá)。
　　 第三部分:高脂喂養(yǎng)對ApoE-/-小鼠胰島的損傷作用及GLP-1的干預(yù)
　　 ApoE-/-小鼠

14、分為普食對照組和高脂喂養(yǎng)組，分別喂養(yǎng)4W、8W、16W和32W。期間進(jìn)行小鼠質(zhì)量及代謝指標(biāo)測定，實(shí)驗(yàn)?zāi)?，取血檢測血糖、血脂。取胰島組織HE染色，進(jìn)行胰島損傷情況的評估;小鼠胰腺Insulin/Glucagon免疫熒光雙標(biāo)記染色;通過免疫印跡檢測PARP-1、iNOS的活性表達(dá)。ApoE-/-小鼠分組進(jìn)行GLP-1和PARP-1抑制劑的干預(yù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)?zāi)┻M(jìn)行小鼠質(zhì)量，代謝指標(biāo)測定和IPGTT/ITT實(shí)驗(yàn)檢測胰島功能，進(jìn)行胰島損傷狀況的評估;

15、小鼠胰腺Insulin/Glucagon免疫熒光雙標(biāo)記染色;通過免疫印跡檢測PARP-1、iNOS、VCAM-1和P-selectin的表達(dá)。進(jìn)一步檢測評估各組過氧化亞硝酸鹽產(chǎn)物水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 第一部分:發(fā)現(xiàn)Ox-LDL對MS-1細(xì)胞有明顯的細(xì)胞毒性作用，且呈劑量依賴性。MS-1細(xì)胞中GLP-1對Ox-LDL引起的iNOS蛋白的表達(dá)的抑制效果是由PARP-1的表達(dá)所介導(dǎo)的。iNOS的表達(dá)水平是隨著PARP

16、-1的水平而改變的。GLP-1(100nmol/L)能夠顯著地抑制iNOS的表達(dá)，和PARP-1抑制劑DPQ(30μM)，iNOS抑制劑1400W（100μM的）有相似的效果。Ox-LDL能夠增加MS-1細(xì)胞NO的生成，而GLP-1能夠中和這種作用，與DPQ，1400W，的作用相似。Ox-LDL顯著增加了MS-1細(xì)胞的凋亡率，而GLP-1，DPQ和1400W的預(yù)處理則減少了TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)。GLP-1R在MS-1細(xì)胞內(nèi)有一定程度的

17、表達(dá)。給予GLP-1R的拮抗劑(Exendin-(9-39))能夠部分抑制了MS-1細(xì)胞的凋亡。因此，對于MS-1細(xì)胞來說，GLP-1是重要的凋亡抑制因子，它通過GLP-1R引起cAMP的上調(diào)，并可能活化蛋白激酶A或其他潛在的途徑，如CREBP和NF-κB途徑，最終抑制PARP-1/iNOS/NO途徑的激活。
　　 第二部分:成功克隆出PARP-1編碼區(qū)全長，經(jīng)測序證實(shí)，無突變、缺失;通過雙酶切、連接等步驟構(gòu)建成pGEM-T-E

18、asy-PARP-1克隆載體;進(jìn)一步將PARP-1基因克隆至PLVX-AcGFP-N1慢病毒表達(dá)載體。使用Clonetech轉(zhuǎn)染試劑盒，將PLVX-AcGFP-N1質(zhì)粒包裝入慢病毒系統(tǒng)，并轉(zhuǎn)染入293FT細(xì)胞，通過熒光顯微鏡觀測到293FT細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)烈的熒光表達(dá)。病毒滴度測定顯示嘌呤霉素對293FT細(xì)胞的最小致死濃度為10μg/ml，最終測得病毒滴度2(×)107pfu/ml。熒光顯微鏡下觀察到PARP-1慢病毒載體可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MS-1細(xì)

19、胞。RT-PCR檢測證實(shí)重組質(zhì)粒在MS-1細(xì)胞內(nèi)有mRNA水平的表達(dá)。
　　 第三部分:與普食組相比，高脂喂養(yǎng)組的ApoE-/-小鼠血漿總膽固醇酯(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平明顯升高（均P＜0.01），并且空腹血糖(FBG)也明顯高于普食組，并且隨著喂養(yǎng)時(shí)間的延長，糖脂代謝紊亂逐漸加重。胰島HE切片顯示高脂組胰島淋巴細(xì)胞浸潤明顯加重，胰島破壞隨喂養(yǎng)時(shí)間增加而加劇。免疫熒光

20、染色顯示胰島的Glucagon分泌增多，胰島素分泌減少。而分組干預(yù)結(jié)果顯示，PARP-1的抑制劑和GLP-1的應(yīng)用可以減輕胰島功能的損傷，并通過抑制粘附因子VCAM-1、P-selectin的表達(dá)，來減輕胰島內(nèi)淋巴細(xì)胞的浸潤、破壞，從而改善ApoE-/-小鼠的血糖及胰島功能。
　　 研究結(jié)論:
　　 1.Ox-LDL可以引起胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，并且其PARP-1和iNOS的活性及NO的生成水平是升高的。GLP-1可

21、以通過下調(diào)PARP-1的表達(dá)，減少PARP-1與iNOS的啟動(dòng)子的結(jié)合，進(jìn)而減輕iNOS/NO的大量生成所造成的內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。
　　 2.成功構(gòu)建了PARP-1基因編碼區(qū)克隆載體及含綠色熒光蛋白的PARP-1真核表達(dá)載體;PARP-1基因在MS-1細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，PARP-1基因在MS-1細(xì)胞中表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)。
　　 3.GLP-1和PARP-1抑制劑可以通過抑制PARP-1/iNOS通路的活性，減少3-NT等氧化應(yīng)

22、激產(chǎn)物的生成，從而在減少α細(xì)胞胰高血糖素水平的同時(shí)增加胰島β細(xì)胞胰島素的生成，同時(shí)還可以通過抑制VCAM-1、P-selectin的生成，減輕胰島淋巴細(xì)胞的浸潤，從而改善高脂條件喂養(yǎng)下ApoE-/-小鼠的胰島功能。
　　 研究意義:
　　 本研究證實(shí)氧化低密度脂蛋白對胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞(MS-1)存在劑量和時(shí)間依賴性的細(xì)胞毒作用，胰島微血管內(nèi)皮有可能是氧化低密度脂蛋白損傷胰島功能的途徑之一。我們還成功構(gòu)建了PARP-1基

23、因編碼區(qū)克隆載體及含綠色熒光蛋白的PARP-1真核表達(dá)載體;并利用此載體進(jìn)一步研究了高脂毒性對ApoE-/-小鼠胰島損傷的機(jī)制及潛在的干預(yù)策略。GLP-1及PAPR-1特異性抑制劑的干預(yù)，可以通過抑制胰島微血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，改善了胰島血管結(jié)構(gòu)和功能，間接改善胰島的氧氣、營養(yǎng)供應(yīng)，同時(shí)還可以直接抑制胰島細(xì)胞內(nèi)PARP-1/iNOS通路的活性，從而在減少α細(xì)胞胰高血糖素水平的同時(shí)增加胰島β細(xì)胞胰島素的生成，同時(shí)還可以通過抑制VCAM-1、