Ghrelin對胰島β細胞脂性凋亡的影響及其分子機制的實驗研究.pdf

1、脂毒性目前被認為是2型糖尿病的主要發(fā)病機制之一。生理條件下,一定的糖和脂對于胰島功能的維持是必不可少的。但是,慢性持續(xù)性的高糖和/或脂信號干預胰島β細胞卻可以引起胰島素基因表達受損,胰島素合成、分泌減少及β細胞凋亡。一系列的研究都證實了脂肪酸在高糖環(huán)境下可以誘導胰島β細胞凋亡。絲氨酸.蘇氨酸激酶Akt,也稱作蛋白激酶B(PKB),在調(diào)節(jié)胰島β細胞功能和結構方面扮演重要的角色。不斷有證據(jù)顯示,PKB蛋白激酶通過磷酸化激活后可以保護胰島β細

2、胞抵抗糖脂毒性的毒副作用。對于胰島β細胞來說,PKB不僅是生長因子信號、細胞因子及其它細胞刺激的關鍵的下游蛋白,也是胰島素信號系統(tǒng)的關鍵靶點。
　　 Ghrelin主要是由胃底X/A樣細胞分泌的,由28個氨基酸組成的生物性多肽,在第3位絲氨酸上帶有辛酰化基團。作為生長激素促泌劑受體的內(nèi)源性配體,它能夠促進生長激素的分泌和調(diào)節(jié)食物攝取。Ghrelin的生物作用廣泛,其中包括調(diào)節(jié)能量和糖代謝穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)多種正常和腫瘤細胞株的增殖、凋亡

3、和分化等功能。近年來,Ghrelin和胰島β細胞之間的關系越來越受到關注。有學者發(fā)現(xiàn)在胰島邊緣可以檢測到單純分泌ghrelin的ε細胞,提示ghrelin不僅可以通過內(nèi)分泌還可能通過旁分泌途徑作用于胰島β細胞。不斷有證據(jù)指出,Ghrelin對胰島細胞增殖、凋亡和功能的調(diào)節(jié)作用是通過生長激素促泌劑受體1a依賴或非依賴的機制介導的。Ghrelin能夠促進胰島β細胞的增殖、抑制干擾素γ(IFN-γ)聯(lián)合腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導的或用阿

4、霉素誘導的胰島β細胞株的凋亡。PI3K/PKB信號通路目前被認為是介導Ghrelin在1型糖尿病中發(fā)揮保護作用的主要通路。而對于2型糖尿病的主要機制之一,脂毒性誘導的胰島D細胞凋亡,Ghrelin能否通過相近的信號通路發(fā)揮保護胰島β細胞的作用,有待于進一步的研究。
　　 因此,本研究的目的主要就是探討ghrelin能否保護胰島β細胞拮抗脂毒性的毒副作用以及探索相關的機制。
　　 材料與方法：
　　 一、實驗材料<

5、br>　　 胰島β細胞株MIN6第10～30代；胃饑餓素(Ghrelin),不含游離脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA),棕櫚酸(PA),Hoechst33258,MTT,PI3K/PKB阻斷劑LY294002,JNK阻斷劑SP600125；實驗使用的蛋白抗體有PKB及其第473位絲氨酸磷酸化一抗,JNK1/2及其磷酸化一抗為兔多抗； TUNEL原位末端POD標記檢測試劑盒；Caspase3活性檢測試劑盒；細胞甘油三脂含量檢測試劑盒；Ann

6、exinV-PI雙染凋亡檢測試劑盒；PCR引物和RT-PCR檢測試劑。
　　 二、實驗方法
　　 1、細胞培養(yǎng)
　　 小鼠胰島β細胞株-MIN6在高糖DMEM培養(yǎng)基和15％胎牛血清中于37℃、5％CO2條件下進行培養(yǎng),培養(yǎng)基中加入100 U/mL青霉素,100 μg/mL鏈霉素,100 μg/mL L-谷氨酰胺,5μL/L β-巰基乙醇。細胞單層生長達80-85％培養(yǎng)面積后,用于實驗或傳代。
　　 2、細

7、胞活性檢測
　　 收集對數(shù)期細胞,調(diào)整細胞懸液濃度,鋪96孔板使待測細胞調(diào)密度至5000細胞/孔,過夜貼壁后,進行實驗干預。細胞活性檢測用MTT法。實驗干預后,每孔加入20μL MTT溶液,繼續(xù)在5％CO2,37℃條件下孵育4h后,小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μL二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀570nm波長處測量各孔的吸光值。
　　 3、Caspase-3活性檢測

8、　　 收集實驗各組細胞(3×106/組),PBS洗二次,10,000 rpm/min離心1 min,去除PBS,沉淀細胞中加入100μL冰冷裂解液和1 μL DTT,混勻。將細胞裂解物移入96孔板,每空加入5μL Caspase-3反應底物(DEVD-pNA),37℃孵育2h。分光光度計在405 nm波長測定其吸光值。
　　 4、TUNEL法檢測細胞凋亡
　　 凋亡檢測方法參照TUNEL原位末端POD標記檢測試劑盒說明

9、書進行,細胞爬片長至80％覆蓋率后,進行實驗處理。加入1 mL的4％甲醛溶液,4℃固定細胞10 min,棄去固定液,PBS洗二次,加入TUNEL反應混合液進行染色和50μLonverter-horse-radish peroxidase(POD)；最后加入DAB反應底物和蘇木素進行復染。光學顯微鏡下計數(shù)細胞凋亡。凋亡的細胞核呈現(xiàn)棕褐色或黑色；正常的細胞核用蘇木素復染成藍核。凋亡率=(凋亡細胞/全部細胞)×100％。
　　 5、H

10、oechst33258染色
　　 細胞爬片放置在6孔板中,加入1 mL的4％甲醛溶液,4℃固定細胞10 min,棄去固定液,PBS洗二次,滴加100μL Hoechst 33258(10ug/mL)工作液,室溫染色10 min,流水沖凈,于340nm波長的熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)細胞凋亡。凋亡細胞核染色質(zhì)聚集或核碎裂。凋亡率=(凋亡細胞/全部細胞)×100％
　　 6、Annexin V-PI雙染,流式細胞儀分析
　

11、　 收集細胞,用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。取5萬重懸的細胞,1000g離心5min,棄上清,加入195μL Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞。加入5μLAnnexin V-FITC,輕輕混勻。室溫(20-25℃)避光孵育10min。1000g離心5min,棄上清,加入190μL Annexin V-FIFC結合液輕輕重懸細胞。加入10μL碘化丙啶(PI)染色液,輕輕混勻,隨即進行流式細胞儀檢測,Annexin V-FIT

12、C為綠色熒光,PI為紅色熒光。
　　 7、電鏡
　　 MIN6細胞在250mL培養(yǎng)瓶中長至80％,進行實驗處理后,用2.5％戊二醛固定后收集細胞,制作電鏡標本,進行觀察。
　　 8、特殊染色法測細胞內(nèi)甘油三脂含量
　　 應用甘油三酯檢測試劑盒(GPO-POD)測定MIN6細胞胞漿甘油三脂含量。收集細胞,PBS沖洗兩遍后在超聲下裂解。將10 uL細胞裂解物或標準品移入96孔板。每孔加入200 uL甘油激酶,

13、70 uL磷酸甘油氧化酶和顯影劑。酶標儀500nm波長下測定吸光度值。繪制標準曲線,通過標準曲線計算胞漿甘油三酯含量。
　　 9、細胞總RNA的提取及RF-PCR檢測
　　 應用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR-)半定量測定SREBP1c、CHOP、BAX、BCL-2和β-actin等基因的表達。提取細胞總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶和hexamers合成cDNA。使用Primer5軟件設計引物,送試劑公司合成。PCR擴增目的基

14、因,在1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離形成目的條帶,溴化乙錠染色成像；測定電泳條帶密度值；掃描成像用Scion Image軟件分析灰度值。
　　 10、Western blot(免疫印記)
　　 應用細胞裂解液提取細胞蛋白,測定蛋白濃度。制備10％聚丙烯酰胺凝膠,進行電泳,轉(zhuǎn)膜,雜交。磷酸化PKB和JNK上樣量為100ug,總PKB和JNK的上樣量為50ug。ECL發(fā)光法測定目的條帶,目的條帶的灰度值用Scion Image軟

15、件分析。
　　 11、統(tǒng)計學分析
　　 應用SPSS 13.0軟件進行單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計分析,結果用均數(shù)±標準差((x)±s)表示,組間差異比較采用Dunnett's檢驗,P<0.05差異有顯著性。
　　 結論：
　　 1、棕櫚酸產(chǎn)生的脂毒性降低MIN6胰島β細胞的細胞活性,引起細胞微觀結構改變,濃度依賴性的誘導細胞凋亡。
　　 2、Ghrelin促進胰島β細胞生長,提高細胞活性,抑制脂