Ghrelin對(duì)胰島β細(xì)胞脂性凋亡的影響及其分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、脂毒性目前被認(rèn)為是2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)制之一。生理?xiàng)l件下,一定的糖和脂對(duì)于胰島功能的維持是必不可少的。但是,慢性持續(xù)性的高糖和/或脂信號(hào)干預(yù)胰島β細(xì)胞卻可以引起胰島素基因表達(dá)受損,胰島素合成、分泌減少及β細(xì)胞凋亡。一系列的研究都證實(shí)了脂肪酸在高糖環(huán)境下可以誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡。絲氨酸.蘇氨酸激酶Akt,也稱作蛋白激酶B(PKB),在調(diào)節(jié)胰島β細(xì)胞功能和結(jié)構(gòu)方面扮演重要的角色。不斷有證據(jù)顯示,PKB蛋白激酶通過(guò)磷酸化激活后可以保護(hù)胰島β細(xì)

2、胞抵抗糖脂毒性的毒副作用。對(duì)于胰島β細(xì)胞來(lái)說(shuō),PKB不僅是生長(zhǎng)因子信號(hào)、細(xì)胞因子及其它細(xì)胞刺激的關(guān)鍵的下游蛋白,也是胰島素信號(hào)系統(tǒng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。
　　 Ghrelin主要是由胃底X/A樣細(xì)胞分泌的,由28個(gè)氨基酸組成的生物性多肽,在第3位絲氨酸上帶有辛?；鶊F(tuán)。作為生長(zhǎng)激素促泌劑受體的內(nèi)源性配體,它能夠促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌和調(diào)節(jié)食物攝取。Ghrelin的生物作用廣泛,其中包括調(diào)節(jié)能量和糖代謝穩(wěn)態(tài),調(diào)節(jié)多種正常和腫瘤細(xì)胞株的增殖、凋亡

3、和分化等功能。近年來(lái),Ghrelin和胰島β細(xì)胞之間的關(guān)系越來(lái)越受到關(guān)注。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在胰島邊緣可以檢測(cè)到單純分泌ghrelin的ε細(xì)胞,提示ghrelin不僅可以通過(guò)內(nèi)分泌還可能通過(guò)旁分泌途徑作用于胰島β細(xì)胞。不斷有證據(jù)指出,Ghrelin對(duì)胰島細(xì)胞增殖、凋亡和功能的調(diào)節(jié)作用是通過(guò)生長(zhǎng)激素促泌劑受體1a依賴或非依賴的機(jī)制介導(dǎo)的。Ghrelin能夠促進(jìn)胰島β細(xì)胞的增殖、抑制干擾素γ(IFN-γ)聯(lián)合腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)的或用阿

4、霉素誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞株的凋亡。PI3K/PKB信號(hào)通路目前被認(rèn)為是介導(dǎo)Ghrelin在1型糖尿病中發(fā)揮保護(hù)作用的主要通路。而對(duì)于2型糖尿病的主要機(jī)制之一,脂毒性誘導(dǎo)的胰島D細(xì)胞凋亡,Ghrelin能否通過(guò)相近的信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)胰島β細(xì)胞的作用,有待于進(jìn)一步的研究。
　　 因此,本研究的目的主要就是探討ghrelin能否保護(hù)胰島β細(xì)胞拮抗脂毒性的毒副作用以及探索相關(guān)的機(jī)制。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料<

5、br>　　 胰島β細(xì)胞株MIN6第10～30代；胃饑餓素(Ghrelin),不含游離脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA),棕櫚酸(PA),Hoechst33258,MTT,PI3K/PKB阻斷劑LY294002,JNK阻斷劑SP600125；實(shí)驗(yàn)使用的蛋白抗體有PKB及其第473位絲氨酸磷酸化一抗,JNK1/2及其磷酸化一抗為兔多抗； TUNEL原位末端POD標(biāo)記檢測(cè)試劑盒；Caspase3活性檢測(cè)試劑盒；細(xì)胞甘油三脂含量檢測(cè)試劑盒；Ann

6、exinV-PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒；PCR引物和RT-PCR檢測(cè)試劑。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)
　　 小鼠胰島β細(xì)胞株-MIN6在高糖DMEM培養(yǎng)基和15％胎牛血清中于37℃、5％CO2條件下進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)基中加入100 U/mL青霉素,100 μg/mL鏈霉素,100 μg/mL L-谷氨酰胺,5μL/L β-巰基乙醇。細(xì)胞單層生長(zhǎng)達(dá)80-85％培養(yǎng)面積后,用于實(shí)驗(yàn)或傳代。
　　 2、細(xì)

7、胞活性檢測(cè)
　　 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞懸液濃度,鋪96孔板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至5000細(xì)胞/孔,過(guò)夜貼壁后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。細(xì)胞活性檢測(cè)用MTT法。實(shí)驗(yàn)干預(yù)后,每孔加入20μL MTT溶液,繼續(xù)在5％CO2,37℃條件下孵育4h后,小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入150μL二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10min,使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀570nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光值。
　　 3、Caspase-3活性檢測(cè)

8、　　 收集實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞(3×106/組),PBS洗二次,10,000 rpm/min離心1 min,去除PBS,沉淀細(xì)胞中加入100μL冰冷裂解液和1 μL DTT,混勻。將細(xì)胞裂解物移入96孔板,每空加入5μL Caspase-3反應(yīng)底物(DEVD-pNA),37℃孵育2h。分光光度計(jì)在405 nm波長(zhǎng)測(cè)定其吸光值。
　　 4、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　 凋亡檢測(cè)方法參照TUNEL原位末端POD標(biāo)記檢測(cè)試劑盒說(shuō)明

9、書進(jìn)行,細(xì)胞爬片長(zhǎng)至80％覆蓋率后,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。加入1 mL的4％甲醛溶液,4℃固定細(xì)胞10 min,棄去固定液,PBS洗二次,加入TUNEL反應(yīng)混合液進(jìn)行染色和50μLonverter-horse-radish peroxidase(POD)；最后加入DAB反應(yīng)底物和蘇木素進(jìn)行復(fù)染。光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡。凋亡的細(xì)胞核呈現(xiàn)棕褐色或黑色；正常的細(xì)胞核用蘇木素復(fù)染成藍(lán)核。凋亡率=(凋亡細(xì)胞/全部細(xì)胞)×100％。
　　 5、H

10、oechst33258染色
　　 細(xì)胞爬片放置在6孔板中,加入1 mL的4％甲醛溶液,4℃固定細(xì)胞10 min,棄去固定液,PBS洗二次,滴加100μL Hoechst 33258(10ug/mL)工作液,室溫染色10 min,流水沖凈,于340nm波長(zhǎng)的熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞凋亡。凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)聚集或核碎裂。凋亡率=(凋亡細(xì)胞/全部細(xì)胞)×100％
　　 6、Annexin V-PI雙染,流式細(xì)胞儀分析
　

11、　 收集細(xì)胞,用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。取5萬(wàn)重懸的細(xì)胞,1000g離心5min,棄上清,加入195μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入5μLAnnexin V-FITC,輕輕混勻。室溫(20-25℃)避光孵育10min。1000g離心5min,棄上清,加入190μL Annexin V-FIFC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10μL碘化丙啶(PI)染色液,輕輕混勻,隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),Annexin V-FIT

12、C為綠色熒光,PI為紅色熒光。
　　 7、電鏡
　　 MIN6細(xì)胞在250mL培養(yǎng)瓶中長(zhǎng)至80％,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理后,用2.5％戊二醛固定后收集細(xì)胞,制作電鏡標(biāo)本,進(jìn)行觀察。
　　 8、特殊染色法測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三脂含量
　　 應(yīng)用甘油三酯檢測(cè)試劑盒(GPO-POD)測(cè)定MIN6細(xì)胞胞漿甘油三脂含量。收集細(xì)胞,PBS沖洗兩遍后在超聲下裂解。將10 uL細(xì)胞裂解物或標(biāo)準(zhǔn)品移入96孔板。每孔加入200 uL甘油激酶,

13、70 uL磷酸甘油氧化酶和顯影劑。酶標(biāo)儀500nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算胞漿甘油三酯含量。
　　 9、細(xì)胞總RNA的提取及RF-PCR檢測(cè)
　　 應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR-)半定量測(cè)定SREBP1c、CHOP、BAX、BCL-2和β-actin等基因的表達(dá)。提取細(xì)胞總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄酶和hexamers合成cDNA。使用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物,送試劑公司合成。PCR擴(kuò)增目的基

14、因,在1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離形成目的條帶,溴化乙錠染色成像；測(cè)定電泳條帶密度值；掃描成像用Scion Image軟件分析灰度值。
　　 10、Western blot(免疫印記)
　　 應(yīng)用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白,測(cè)定蛋白濃度。制備10％聚丙烯酰胺凝膠,進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜,雜交。磷酸化PKB和JNK上樣量為100ug,總PKB和JNK的上樣量為50ug。ECL發(fā)光法測(cè)定目的條帶,目的條帶的灰度值用Scion Image軟

15、件分析。
　　 11、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,組間差異比較采用Dunnett's檢驗(yàn),P<0.05差異有顯著性。
　　 結(jié)論：
　　 1、棕櫚酸產(chǎn)生的脂毒性降低MIN6胰島β細(xì)胞的細(xì)胞活性,引起細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)改變,濃度依賴性的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 2、Ghrelin促進(jìn)胰島β細(xì)胞生長(zhǎng),提高細(xì)胞活性,抑制脂