脂聯(lián)素通過(guò)mTOR信號(hào)通路抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制研究.pdf

1、目的:本研究主要探討人脂聯(lián)素重組體通過(guò)mTOR信號(hào)通路在骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展中的抑制作用機(jī)制以及對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，為骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究提供新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　方法:1、收集10例臨床確診骨肉瘤且未經(jīng)化療的患者為實(shí)驗(yàn)組，10例年齡、性別、體重指數(shù)相匹配的正常人為對(duì)照組，分別抽取血液標(biāo)本，離心后取上清，用Western Blot法檢測(cè)其血清中脂聯(lián)素(Adiponectin)的表達(dá)水平。
　　2、對(duì)處于對(duì)數(shù)生

2、長(zhǎng)期的正常成骨細(xì)胞hFOB1.19及三種人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63、SaOS-2、U2OS分別提取蛋白后，Western Blot法檢測(cè)以上四種細(xì)胞的脂聯(lián)素受體1(Adiponectin receptor1，AdipoR1)及脂聯(lián)素受體2（Adiponectin receptor2，AdipoR2）的表達(dá)水平。
　　3、對(duì)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞分別以1μg/ml的人脂聯(lián)素重組體處理不同時(shí)間，Western Blot法檢測(cè)AM

3、PK、ACC蛋白磷酸化水平，確定最佳的脂聯(lián)素作用時(shí)間;然后根據(jù)脂聯(lián)素最佳作用時(shí)間，選擇不同濃度的脂聯(lián)素作用于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞后，WesternBlot法檢測(cè)AMPK、ACC、Akt、ERK、S6K、4EBP1蛋白磷酸化水平并確定最佳的脂聯(lián)素作用時(shí)間。
　　4、CCK-8法檢測(cè)不同濃度的人脂聯(lián)素重組體對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的影響。
　　5、劃痕法檢測(cè)不同濃度的人脂聯(lián)素重組體對(duì)MG-63細(xì)胞遷移能力的影響。
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4、、對(duì)MG-63細(xì)胞予以LY294002（50μmol/l）預(yù)刺激1小時(shí)后，用人脂聯(lián)素重組體以最佳作用濃度刺激該細(xì)胞24h后，對(duì)其行侵襲能力檢測(cè);同時(shí)對(duì)該細(xì)胞內(nèi)Akt、S6K1、4EBP1蛋白水平及磷酸化水平的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:脂聯(lián)素(Adiponectin)在骨肉瘤患者血清中的表達(dá)水平低于正常人(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常成骨細(xì)胞hFOB1.19相比，人骨肉瘤細(xì)胞株MG-63細(xì)胞、SaOS-2細(xì)胞、U2OS細(xì)

5、胞的AdipoR1表達(dá)水平顯著增高(P＜0.01)，AdipoR2的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異。脂聯(lián)素對(duì)MG-63細(xì)胞最佳作用時(shí)間為30min，最佳作用濃度1μg/ml。與對(duì)照組相比，經(jīng)脂聯(lián)素處理的MG-63細(xì)胞AMPK、ACC磷酸化水平顯著增高(P＜0.01)，Akt、ERK、S6K、4EBP1的磷酸化水平顯著下降(P＜0.01)。通過(guò)CCK-8檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)人脂聯(lián)素重組體能顯著降低MG-63細(xì)胞體外增殖(P＜0.01)，并且在一定濃度范圍內(nèi)與

6、濃度大小成正相關(guān)關(guān)系。劃痕試驗(yàn)證實(shí)，脂聯(lián)素抑制MG-63細(xì)胞的遷移能力，并且在一定濃度范圍內(nèi)與濃度大小成正相關(guān)關(guān)系。侵襲實(shí)驗(yàn)證實(shí)，脂聯(lián)素、PI3K抑制劑LY294002及兩者聯(lián)合應(yīng)用均抑制骨肉瘤MG-63的侵襲能力。經(jīng)PI3K抑制劑LY294002及其聯(lián)合脂聯(lián)素處理后，MG-63細(xì)胞中Akt、ERK、S6K、4EBP1的磷酸化水平顯著下降(P＜0.01)。
　　結(jié)論:脂聯(lián)素具有抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的作用，可能通過(guò)AMPK