SAHA增敏順鉑對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制及其作用機(jī)制研究.pdf

1、骨肉瘤是最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，尤以15-19歲的青少年多見，其發(fā)病率為4/百萬，且男性患病率約為女性的1.4倍。目前臨床治療骨肉瘤除手術(shù)切除外，化療仍以阿霉素(ADM)、順鉑(CDDP)、甲氨蝶呤(MTX)為主，隨著新輔助化療的發(fā)展，患者5年生存率已上升到65-75％。盡管如此，對(duì)于治療骨肉瘤新藥的研發(fā)卻少之又少，而且，對(duì)于肺轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的患者，其預(yù)后更差，至今尚無有效可行的方案。因此，研發(fā)高效低毒的新型抗骨肉瘤藥物或化療增敏藥物，可作

2、為目前骨肉瘤治療中的一大方向。伏立諾他（辛二酰苯胺異羥肟酸，SAHA）是第一個(gè)于2006年經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)用于臨床治療皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL)的組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)類藥物，它可通過誘導(dǎo)細(xì)胞分化、阻斷細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)控而發(fā)揮作用。順鉑(cisplatin，CDDP)，是一種細(xì)胞周期非特異性藥物，其可通過抑制腫瘤細(xì)胞的DNA復(fù)制，損傷腫瘤

3、細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，而發(fā)揮著較強(qiáng)的抗癌作用并被廣泛應(yīng)用于臨床，同時(shí)它也是治療骨肉瘤的一線化療藥物。鑒于新藥研發(fā)的困難和應(yīng)用增敏藥物的啟示，以及兩類藥物的作用原理，我們?cè)O(shè)計(jì)了聯(lián)合用藥的相關(guān)課題，本課題將通過以下三部分來探討:SAHA與CDDP聯(lián)合作用后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制情況;體內(nèi)抑瘤效果;以及二者作用的可能分子機(jī)制。這對(duì)進(jìn)一步揭示骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制具有重要意義，并為骨肉瘤患者的臨床治療帶來新的思路。本研究分為三個(gè)部分：
　　第一部分：S

4、AHA聯(lián)合CDDP對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖抑制的研究。
　　目的：觀察二者聯(lián)合后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制以及細(xì)胞周期變化，凋亡與自噬。
　　方法：通過細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)(MTS)來觀察對(duì)骨肉瘤細(xì)胞（HOS和U20S）的增殖抑制效果;通過流式細(xì)胞儀(FCM)來分析細(xì)胞周期阻滯與凋亡的變化，通過透射電子顯微鏡(TEM)來觀察細(xì)胞自噬的情況。
　　結(jié)果：SAHA聯(lián)合CDDP后可顯著抑制HOS與U20S細(xì)胞的增殖，聯(lián)合組與對(duì)照組相比有顯著

5、性差異（P＜0.05），而對(duì)正常的人成骨細(xì)胞(hFOB)抑制作用較弱;同時(shí)引起細(xì)胞S期阻滯，細(xì)胞凋亡比例明顯增加;誘導(dǎo)了自噬小體的形成。
　　結(jié)論：SAHA增敏了CDDP對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株HOS與U20S的增殖抑制作用，但對(duì)hFOB細(xì)胞抑制較弱;誘導(dǎo)了自噬的發(fā)生。
　　第二部分：SAHA聯(lián)合CDDP對(duì)荷瘤裸鼠的體內(nèi)抑瘤效果研究。
　　目的： 觀察SAHA聯(lián)合CDDP對(duì)異位骨肉瘤裸鼠模型的抑瘤效果
　　方法：首先應(yīng)用H

6、OS細(xì)胞株建立骨肉瘤的裸鼠皮下移植瘤模型，并將動(dòng)物分為四組:對(duì)照組、SAHA組、CDDP組和SAHA+CDDP聯(lián)合治療組，后經(jīng)腹腔注射給藥，觀察裸鼠體重和腫瘤體積變化。
　　結(jié)果：SAHA+CDDP聯(lián)合組顯著抑制了腫瘤的生長，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而體重在CDDP單藥組和聯(lián)合組均出現(xiàn)了先降低后逐漸回升的變化趨勢。
　　結(jié)論：在裸鼠體內(nèi)同時(shí)應(yīng)用SAHA與CDDP，可顯著抑制腫瘤生長。
　　第三部

7、分：SAHA聯(lián)合CDDP抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制研究。
　　目的：探討SAHA聯(lián)合CDDP作用于骨肉瘤細(xì)胞引起凋亡與自噬相關(guān)信號(hào)通路的變化
　　方法：應(yīng)用FCM檢測活性氧(ROS)的變化， real-time PCR檢測相關(guān)周期基因的變化，Western Blot檢測凋亡(Caspases)信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ER stress)信號(hào)通路以及自噬相關(guān)蛋白的變化。
　　結(jié)果：應(yīng)用抗氧化劑(NAC)后，可部分抵抗二者

8、聯(lián)合對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖抑制作用;SAHA聯(lián)合CDDP引起了周期相關(guān)基因CyclinA2、CyclinE、CDK2、p21的變化，使得p21和CDK2表達(dá)增加，CyclinA2和CyclinE表達(dá)減少。Western Blot結(jié)果示:Caspases家族蛋白表達(dá)增加; ER stress相關(guān)蛋白PERK與eIF2α變化不明顯;自噬蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的比例增加而且加入自噬抑制劑3-MA和CQ后，凋亡蛋白表達(dá)增加。
　　結(jié)論：在引起骨肉