順鉑通過miR-376c-TGFA抑制骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖的研究.pdf

1、目的:DDP是廣譜抗癌藥，為鉑的金屬絡(luò)合物，作用似烷化劑，主要作用靶點為DNA，屬細(xì)胞周期非特異性藥物，但由于大劑量化療的毒副反應(yīng)、腫瘤細(xì)胞的突變、原發(fā)或繼發(fā)的化療藥物耐藥、早期肺轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)等問題，導(dǎo)致近二十年來骨肉瘤患者的生存率無法繼續(xù)顯著提高。尋找一種新的有效、可行、副作用小的骨肉瘤治療方法，將在很大程度上改變骨肉瘤患者的治療現(xiàn)狀。本課題擬研究DDP上調(diào)miR-376c下調(diào)TGFA抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖的功能學(xué)效應(yīng)，以期為尋找骨肉瘤

2、的防治靶標(biāo)提供堅實基礎(chǔ)。
　　方法:1、構(gòu)建TGFA shRNA載體，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，QPCR和Western blot檢測TGFA沉默效率;2、轉(zhuǎn)染TGFA-shRNA，用MTT法和BrdU法檢測Saos-2細(xì)胞的生長和細(xì)胞DNA的合成;3、DDP與TGFA ORF clone聯(lián)合處理Saos-2細(xì)胞，用MTT法和BrdU法檢測Saos-2細(xì)胞的生長和細(xì)胞DNA的合成;4、化學(xué)合成miR-376cmimics和構(gòu)建m

3、iR-376c Sponge載體，用QPCR檢測miR-376c的表達(dá);5、DDP與miR-376c以及miR-376c Sponge聯(lián)合處理時，用MTT法和BrdU法檢測Saos-2細(xì)胞的生長和細(xì)胞DNA的合成;6、用熒光素酶報告基因檢測miR-376c與TGFA的靶向調(diào)控作用;7、DDP與miR-376c Sponge聯(lián)合處理Saos-2細(xì)胞，Western blot檢測PI3K/AKT通路活性;8、miR-376c與TGFA聯(lián)合處

4、理Saos-2細(xì)胞，Western blot檢測PI3K/AKT通路活性。
　　結(jié)果:1、TGFA-shRNA轉(zhuǎn)染Saos-2細(xì)胞，可沉默70％左右TGFA的表達(dá);2、轉(zhuǎn)染TGFA shRNA可顯著抑制Saos-2細(xì)胞的生長與細(xì)胞DNA的合成;3、DDP濃度為2.5 mg/L時，即可顯著抑制TGFA的表達(dá)，DDP與TGFA ORF clone聯(lián)合處理Saos-2細(xì)胞時，可回復(fù)DDP對細(xì)胞增殖的抑制作用;4、miR-376c mim

5、ics可使miR-376c過表達(dá)約50倍，miR-376c Sponge可下調(diào)miR-376c表達(dá)約70％;5、DDP與miR-376c聯(lián)合處理細(xì)胞相較于DDP單獨作用，可更加顯著的抑制Saos-2細(xì)胞的增殖，DDP與miR-376c Sponge聯(lián)合處理細(xì)胞相較于DDP單獨作用，可回復(fù)DDP對Saos-2細(xì)胞的抑制作用;6、miR-376c可與TGFA的3'UTR區(qū)直接相互作用而抑制TGFA的表達(dá);7、DDP與miR-376c Spo

6、nge聯(lián)合處理Saos-2細(xì)胞相較于DDP單獨作用，不可改變PI3K和AKT總蛋白的表達(dá)，但可回復(fù)DDP對磷酸化PI3K和磷酸化AKT表達(dá)抑制;8、miR-376c與TGFA聯(lián)合處理Saos-2細(xì)胞相較于miR-376c單獨作用，不可改變PI3K和AKT總蛋白的表達(dá)，但可回復(fù)DDP對磷酸化PI3K和磷酸化AKT表達(dá)抑制。
　　結(jié)論:1、DDP可通過下調(diào)TGFA抑制骨肉瘤Saos-2細(xì)胞增殖;2、DDP可通過上調(diào)miR-376c抑制