蟾蜍靈誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞SaoS-2和u-2os調(diào)亡及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:探討蟾蜍靈(Bufalin)誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞Saos-2和U-2os凋亡，抑制其體外增殖的機(jī)制，為臨床骨肉瘤的綜合治療提供新的思路。
　　 方法:采用不同濃度的蟾蜍靈分別作用于人骨肉瘤Saos-2和U-2os細(xì)胞系，CCK8法檢測細(xì)胞增殖抑制率，Hoechst33258染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)的改變，JC-1法檢測用藥前后細(xì)胞線粒體膜電位變化，2，7-雙氫二氯熒光黃染色法檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的水平。流式細(xì)胞

2、儀AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡。Micro-array分析0.25umol/L蟾蜍靈作用前后Saos-2細(xì)胞microRNA表達(dá)譜差異。Real-TimePCR法檢測在骨肉瘤細(xì)胞中表達(dá)異常的miRNA-29a的變化。Targetscan軟件預(yù)測miR-29a靶標(biāo)，熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-29a與其靶向蛋白BBC3(PUMA)的調(diào)控關(guān)系。WesternBlotting法檢測蟾蜍靈處理后骨肉瘤細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白PUMA表達(dá)變

3、化。
　　 結(jié)果:10nmol/L以上濃度的蟾蜍靈作用于人骨肉瘤細(xì)胞Saos-2和U-2os細(xì)胞抑制率在20％以上(p＜0.05)，且呈量效依賴性抑制腫瘤細(xì)胞增殖。蟾蜍靈作用Saos-2和U-2os細(xì)胞增殖24h的IC50分別為0.28±0.05umol/L和0.35±0.09umol/L。2，7-雙氫二氯熒光黃染色法顯示骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧水平隨藥物濃度增加而增多，細(xì)胞線粒體膜電位隨藥物濃度增加而逐漸減低，提示蟾蜍靈通過激活線粒

4、體凋亡途徑，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。蟾蜍靈(Bufalin)作用于骨肉瘤細(xì)胞后可引起miRNA-29a表達(dá)下調(diào)(p＜0.05)，且呈濃度依賴性。熒光素酶試驗(yàn)證實(shí)，miRNA-29a靶向負(fù)調(diào)控BBC3，后者隨藥物濃度升高而升高。細(xì)胞凋亡死亡率與之正相關(guān)，亦呈濃度依賴性。
　　 結(jié)論:蟾蜍靈通過抑制miRNA-29a水平，上調(diào)其靶蛋白PUMA表達(dá)上調(diào)，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧激活線粒體凋亡途徑，呈濃度依賴性誘導(dǎo)人骨肉瘤Saos-2和