蜂毒素抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG63活力及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景及目的：
　　骨肉瘤(osteosarcoma)是臨床上最常見(jiàn)的惡性成骨性腫瘤之一。在我國(guó)，骨肉瘤發(fā)病率在原發(fā)惡性骨腫瘤中居首位。化療的出現(xiàn)為骨肉瘤的治療開(kāi)辟了嶄新的天地?，F(xiàn)代骨肉瘤的治療主要采取以手術(shù)為主的綜合治療，包括手術(shù)前化療、手術(shù)和術(shù)后定期化療，同時(shí)配合免疫和生物療法等綜合治療方法?；熢谥委熯^(guò)程中的作用不可替代，但聯(lián)合輔助化療長(zhǎng)期用藥對(duì)機(jī)體的毒副作用以及腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生又成為近年來(lái)困擾臨床的一大難題。這一現(xiàn)實(shí)

2、驅(qū)使人們不斷探索新的化療藥物用于骨肉瘤的治療。蜂毒素(MEL，melittin)是蜂毒的主要活性成分，具有高度的生物學(xué)活性。近年來(lái)，有關(guān)蜂毒素的抗腫瘤作用日益引起人們的重視。研究表明，蜂毒素具有廣泛的抗瘤活性，其抗瘤機(jī)制包括直接殺傷、免疫調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制轉(zhuǎn)移和血管生成等。雖然很多實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明蜂毒素具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡的作用，但其對(duì)于骨肉瘤細(xì)胞的作用效果，國(guó)內(nèi)外鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選取人骨肉瘤細(xì)胞株MG63作為研究對(duì)

3、象，觀察蜂毒素對(duì)MG63細(xì)胞活力及凋亡的影響，并進(jìn)一步研究其可能作用機(jī)制、為其應(yīng)用于臨床提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)材料：
　　1.細(xì)胞及蜂毒素人骨肉瘤MG63細(xì)胞株，人胎兒成骨細(xì)胞Hfob1.19細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。蜂毒素由第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)科實(shí)驗(yàn)室提供。
　　2.主要試劑及儀器MTT-華美生物工程公司，RTPCR試劑盒-美國(guó)invitrogen公司，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒-南

4、京凱基公司，Western blot實(shí)驗(yàn)裝置-美國(guó)GE公司，流式細(xì)胞儀-美國(guó)BD公司。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):人骨肉瘤細(xì)胞MG63及人胎兒成骨細(xì)胞Hfob1.19貼壁生長(zhǎng)于含10％熱滅活胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM高糖型培養(yǎng)液中，培養(yǎng)瓶置于37℃，含5％CO2的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　2.構(gòu)建含蜂毒素基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)

5、細(xì)胞:提取蜂毒素肽總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，根據(jù)genebank設(shè)計(jì)引物，反克隆MEL基因。MEL基因與載體連接，構(gòu)建真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組:蜂毒素基因轉(zhuǎn)染的MG63、Hfob1.19細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)A組（MEL-express組），蜂毒素肽孵育的MG63、Hfob1.19細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)B組(MEL-pep組)，未處理細(xì)胞為對(duì)照組（con組）
　　4.蜂毒素孵育實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:使用生理鹽水配制蜂毒素溶液，調(diào)

6、整溶液濃度，加入容納實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中，搖勻，使蜂毒素終濃度約為32μg/ml，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。
　　5.采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)蜂毒素對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞MG63和人胎兒成骨細(xì)胞Hfob1.19的活力抑制作用:取蜂毒素轉(zhuǎn)染、孵育及未處理的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并制成單細(xì)胞懸液，加入MTT及二甲亞砜，全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光密度值。計(jì)算活細(xì)胞率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
　　6.采用流式細(xì)胞儀

7、檢測(cè)細(xì)胞凋亡(Annexin V-FITC/PI標(biāo)記法):實(shí)驗(yàn)細(xì)胞用0.25％的胰酶消化，離心，置于流式管中，加入FITC標(biāo)記的AnnexinV5μl，10μlPI(Propidium Iodide)染液(50mg/L)，1小時(shí)內(nèi)上流式細(xì)胞儀完成檢測(cè)。使用CELLQuest軟件檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。
　　7.采用Western-blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)IRE-a、p-Perk、AFT-6，Caspase-12和CHOP蛋白表達(dá):

8、用數(shù)字成像儀對(duì)硝酸纖維素膜進(jìn)行圖像掃描分析，比較不同組之間蛋白表達(dá)峰面積的差異。
　　8.RT-PCR分析XBP1，EIF-2a，TRAF2mRNA水平的變化:采用kodak2.0軟件對(duì)PCR瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物進(jìn)行掃描分析，數(shù)據(jù)處理。
　　結(jié)果：
　　人骨肉瘤細(xì)胞MG63和人胎兒成骨細(xì)胞Hfob1.19經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)染或蜂毒素孵育處理后細(xì)胞內(nèi)均有較高水平的蜂毒素存在。MTT分析顯示，人胎兒成骨細(xì)胞Hfob1.19經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)

9、染或蜂毒素孵育處理后，活細(xì)胞率與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，而人骨肉瘤細(xì)胞MG63經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)染或蜂毒素孵育處理后，活細(xì)胞率顯著低于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，人胎兒成骨細(xì)胞Hfob1.19經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)染或蜂毒素孵育處理后，凋亡細(xì)胞比例與對(duì)照組比較沒(méi)有顯著性差別，人骨肉瘤細(xì)胞MG63經(jīng)蜂毒素處理后，凋亡細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。蜂毒素轉(zhuǎn)染和蜂毒素孵育兩組間差異無(wú)顯著性。Western-blot顯

10、示，人骨肉瘤細(xì)胞MG63和人胎兒成骨細(xì)胞Hfob1.19經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)染或蜂毒素孵育處理后，細(xì)胞表達(dá)未折疊蛋白反應(yīng)因子IRE-a，p-Perk，AFT-6較對(duì)照組均有增強(qiáng)，但只有人骨肉瘤細(xì)胞MG63中IRE-a的表達(dá)明顯增高，與對(duì)照組相比，差異具有顯著性。人胎兒成骨細(xì)胞Hfob1.19經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)染或蜂毒素孵育處理后，細(xì)胞中Caspase12和CHOP蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，但人骨肉瘤MG63細(xì)胞表達(dá)CHOP蛋白明顯增強(qiáng)，差異具有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游蛋白XBP1，EIF2-a，TRAF2mRNA結(jié)果顯示，人骨肉瘤細(xì)胞MG63經(jīng)蜂毒素處理后，細(xì)胞表達(dá)XBP1mRNA水平較對(duì)照組明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：
　　1.MEL能特異性抑制MG63細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　2.MEL抑制MG63細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡這一過(guò)程可能是通過(guò)活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白反應(yīng)的IRE-a信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　3.CHOP蛋