蜂毒素抑制人骨肉瘤細胞MG63活力及其作用機制的實驗研究.pdf

1、實驗背景及目的：
　　骨肉瘤(osteosarcoma)是臨床上最常見的惡性成骨性腫瘤之一。在我國，骨肉瘤發(fā)病率在原發(fā)惡性骨腫瘤中居首位?；煹某霈F(xiàn)為骨肉瘤的治療開辟了嶄新的天地。現(xiàn)代骨肉瘤的治療主要采取以手術(shù)為主的綜合治療，包括手術(shù)前化療、手術(shù)和術(shù)后定期化療，同時配合免疫和生物療法等綜合治療方法?；熢谥委熯^程中的作用不可替代，但聯(lián)合輔助化療長期用藥對機體的毒副作用以及腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生又成為近年來困擾臨床的一大難題。這一現(xiàn)實

2、驅(qū)使人們不斷探索新的化療藥物用于骨肉瘤的治療。蜂毒素(MEL，melittin)是蜂毒的主要活性成分，具有高度的生物學活性。近年來，有關(guān)蜂毒素的抗腫瘤作用日益引起人們的重視。研究表明，蜂毒素具有廣泛的抗瘤活性，其抗瘤機制包括直接殺傷、免疫調(diào)節(jié)，誘導細胞凋亡、抑制轉(zhuǎn)移和血管生成等。雖然很多實驗已經(jīng)證明蜂毒素具有抑制多種腫瘤細胞增殖和促進凋亡的作用，但其對于骨肉瘤細胞的作用效果，國內(nèi)外鮮有文獻報道。本實驗選取人骨肉瘤細胞株MG63作為研究對

3、象，觀察蜂毒素對MG63細胞活力及凋亡的影響，并進一步研究其可能作用機制、為其應(yīng)用于臨床提供理論和實驗依據(jù)。
　　實驗材料：
　　1.細胞及蜂毒素人骨肉瘤MG63細胞株，人胎兒成骨細胞Hfob1.19細胞株由中國科學院細胞庫提供。蜂毒素由第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院中醫(yī)科實驗室提供。
　　2.主要試劑及儀器MTT-華美生物工程公司，RTPCR試劑盒-美國invitrogen公司，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒-南

4、京凱基公司，Western blot實驗裝置-美國GE公司，流式細胞儀-美國BD公司。
　　實驗方法：
　　1.細胞培養(yǎng):人骨肉瘤細胞MG63及人胎兒成骨細胞Hfob1.19貼壁生長于含10％熱滅活胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM高糖型培養(yǎng)液中，培養(yǎng)瓶置于37℃，含5％CO2的飽和濕度孵育箱中培養(yǎng)。每隔2-3天進行傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。
　　2.構(gòu)建含蜂毒素基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染實驗

5、細胞:提取蜂毒素肽總RNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，根據(jù)genebank設(shè)計引物，反克隆MEL基因。MEL基因與載體連接，構(gòu)建真核表達載體，并轉(zhuǎn)染實驗細胞。
　　3.實驗分組:蜂毒素基因轉(zhuǎn)染的MG63、Hfob1.19細胞為實驗A組（MEL-express組），蜂毒素肽孵育的MG63、Hfob1.19細胞為實驗B組(MEL-pep組)，未處理細胞為對照組（con組）
　　4.蜂毒素孵育實驗細胞:使用生理鹽水配制蜂毒素溶液，調(diào)

6、整溶液濃度，加入容納實驗細胞的培養(yǎng)瓶中，搖勻，使蜂毒素終濃度約為32μg/ml，37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)箱中孵育24小時。
　　5.采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測蜂毒素對人骨肉瘤細胞MG63和人胎兒成骨細胞Hfob1.19的活力抑制作用:取蜂毒素轉(zhuǎn)染、孵育及未處理的處于對數(shù)生長期細胞并制成單細胞懸液，加入MTT及二甲亞砜，全自動酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔光密度值。計算活細胞率。實驗重復3次。
　　6.采用流式細胞儀

7、檢測細胞凋亡(Annexin V-FITC/PI標記法):實驗細胞用0.25％的胰酶消化，離心，置于流式管中，加入FITC標記的AnnexinV5μl，10μlPI(Propidium Iodide)染液(50mg/L)，1小時內(nèi)上流式細胞儀完成檢測。使用CELLQuest軟件檢測細胞凋亡率。
　　7.采用Western-blotting法檢測各組細胞內(nèi)IRE-a、p-Perk、AFT-6，Caspase-12和CHOP蛋白表達:

8、用數(shù)字成像儀對硝酸纖維素膜進行圖像掃描分析，比較不同組之間蛋白表達峰面積的差異。
　　8.RT-PCR分析XBP1，EIF-2a，TRAF2mRNA水平的變化:采用kodak2.0軟件對PCR瓊脂糖凝膠電泳產(chǎn)物進行掃描分析，數(shù)據(jù)處理。
　　結(jié)果：
　　人骨肉瘤細胞MG63和人胎兒成骨細胞Hfob1.19經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)染或蜂毒素孵育處理后細胞內(nèi)均有較高水平的蜂毒素存在。MTT分析顯示，人胎兒成骨細胞Hfob1.19經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)

9、染或蜂毒素孵育處理后，活細胞率與對照組比較無顯著性差異，而人骨肉瘤細胞MG63經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)染或蜂毒素孵育處理后，活細胞率顯著低于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，人胎兒成骨細胞Hfob1.19經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)染或蜂毒素孵育處理后，凋亡細胞比例與對照組比較沒有顯著性差別，人骨肉瘤細胞MG63經(jīng)蜂毒素處理后，凋亡細胞比例顯著高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。蜂毒素轉(zhuǎn)染和蜂毒素孵育兩組間差異無顯著性。Western-blot顯

10、示，人骨肉瘤細胞MG63和人胎兒成骨細胞Hfob1.19經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)染或蜂毒素孵育處理后，細胞表達未折疊蛋白反應(yīng)因子IRE-a，p-Perk，AFT-6較對照組均有增強，但只有人骨肉瘤細胞MG63中IRE-a的表達明顯增高，與對照組相比，差異具有顯著性。人胎兒成骨細胞Hfob1.19經(jīng)蜂毒素轉(zhuǎn)染或蜂毒素孵育處理后，細胞中Caspase12和CHOP蛋白的表達與對照組比較無顯著性差異，但人骨肉瘤MG63細胞表達CHOP蛋白明顯增強，差異具有

11、統(tǒng)計學意義。RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下游蛋白XBP1，EIF2-a，TRAF2mRNA結(jié)果顯示，人骨肉瘤細胞MG63經(jīng)蜂毒素處理后，細胞表達XBP1mRNA水平較對照組明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　1.MEL能特異性抑制MG63細胞活力并誘導細胞凋亡。
　　2.MEL抑制MG63細胞活力并誘導細胞凋亡這一過程可能是通過活化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激未折疊蛋白反應(yīng)的IRE-a信號通路實現(xiàn)的。
　　3.CHOP蛋