曲克蘆丁對(duì)STZ糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙及海馬谷氨酸半胱氨酸連接酶亞單位GCLC、GCLM的影響.pdf

1、目的:糖尿病是當(dāng)代危害人類健康的三大疾病之一，糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變是目前研究熱點(diǎn)之一，主要表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙如學(xué)習(xí)、記憶能力下降。氧化應(yīng)激是其重要發(fā)病機(jī)制之一。過氧化脂質(zhì)(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是反映體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平的經(jīng)典指標(biāo)。SOD、GSH均具有很強(qiáng)的抗氧化能力，谷氨酰半胱氨酸連接酶(Glutam

2、atecysteine ligase，GCL)是GSH的合成限速酶，其催化亞基GCLC和調(diào)節(jié)亞基GCLM是非常重要的抗氧化蛋白酶，對(duì)抗氧化應(yīng)激能力的提高有重要作用。本實(shí)驗(yàn)以α-硫辛酸為對(duì)照，觀察曲克蘆丁對(duì)認(rèn)知功能及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)(MDA，SOD，GSH，GCLC，GCLM)的影響，為糖尿病認(rèn)知障礙治療提供新方向。
　　 方法:
　　 1、STZ糖尿病大鼠模型制備
　　 雄性Sprague Dawley(SD)大

3、鼠，腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)60mg/kg，72小時(shí)后尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖值大于等于16.7mmol/L者納入STZ糖尿病大鼠。
　　 2、分組
　　 SD大鼠共70只，150g-170g，隨機(jī)分為:正常對(duì)照組(NC，10只)，糖尿病組（DM，60只）;動(dòng)物成模后第12周，糖尿病組隨機(jī)分為:生理鹽水組（DN，腹腔注射等體積生理鹽水，15只），糖尿病對(duì)照組(DC，15只)，α-硫辛酸干預(yù)

4、組（DL，α-硫辛酸60mg/kg/d腹腔注射，15只），曲克蘆丁干預(yù)組（DT，曲克蘆丁60mg/kg/d腹腔注射，15只），均干預(yù)6周。
　　 3、一般觀察
　　 大鼠精神狀態(tài)，進(jìn)食量，進(jìn)水量，尿量，血糖，體重情況。
　　 4、行為學(xué)觀察
　　 分別于成模第1、12、18周行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，記錄大鼠逃避潛伏期，分析各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。
　　 5、標(biāo)本制備及觀察指標(biāo)
　　 成模第

5、18周（即給藥6周后），取新鮮海馬組織，用HE染色法觀察海馬組織結(jié)構(gòu)，應(yīng)用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定海馬SOD的活力，硫代巴比妥酸法測(cè)定海馬MDA含量，雙縮脲法測(cè)定GSH含量，提取DNA并應(yīng)用Real-TimePCR法檢測(cè)GCLC、GCLMmRNA的表達(dá)量，提取蛋白應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)GCLC、GCLM蛋白含量。
　　 6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包，對(duì)所測(cè)定結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性及方差

6、齊性檢驗(yàn)，應(yīng)用重復(fù)測(cè)量方差分析、多元方差分析及完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，用(x)±s表示統(tǒng)計(jì)結(jié)果，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1、一般情況觀察
　　 正常對(duì)照組大鼠皮毛純白有光澤，精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈敏，飲水量、進(jìn)食量及尿量正常，體重穩(wěn)步增長(zhǎng);糖尿病組大鼠毛色稀疏枯黃污穢且無(wú)光澤，皮膚變薄，易激惹，精神萎靡，多尿、多飲、多食、體重明顯下降(P＜0.05)，血糖較正常組明顯升高

7、(P＜0.01)。
　　 2、行為學(xué)觀察（Morris水迷宮結(jié)果）
　　 成模第1周，糖尿病組與正常對(duì)照組間無(wú)顯著差別（P＞0.05）;
　　 成模第12周（藥物干預(yù)前），糖尿病組較正常對(duì)照組逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P＜0.05);
　　 成模第18周（藥物干預(yù)6周后），α-硫辛酸干預(yù)組與曲克蘆丁干預(yù)組均較糖尿病對(duì)照組及糖尿病鹽水組逃避潛伏期明顯縮短，但仍高于正常對(duì)照組(P＜0.05);α-硫辛酸干預(yù)組與曲克

8、蘆丁干預(yù)組間無(wú)顯著差異(P＞0.05);糖尿病鹽水組與糖尿病對(duì)照組間無(wú)顯著差異（P＞0.05），組別和天數(shù)之間不存在交互作用(P＞0.05)。
　　 3、海馬組織GCLMmRNA及蛋白的表達(dá)
　　 3.1、海馬組織GCLMmRNA的表達(dá)
　　 與正常對(duì)照組(1±0)相比，糖尿病對(duì)照組（0.790±0.012）、糖尿病鹽水組（0.863±0.097）海馬GCLMmRNA的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）;糖尿病對(duì)照組與

9、糖尿病鹽水組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。與糖尿病對(duì)照組及糖尿病鹽水組相比，α-硫辛酸干預(yù)組（1.510±0.115）與曲克蘆丁干預(yù)組（1.207±0.011）海馬GCLMmRNA的表達(dá)顯著增高（P＜0.05）;α-硫辛酸干預(yù)組GCLMmRNA表達(dá)高于曲克蘆丁干預(yù)組（P＜0.05）。
　　 3.2、海馬組織GCLM蛋白表達(dá)
　　 正常對(duì)照組（1±0）、糖尿病對(duì)照組（0.999±0.003）、糖尿病鹽水組（1.000±0.

10、002）、α-硫辛酸干預(yù)組（0.999±0.001）、曲克蘆丁干預(yù)組（0.999±0.002）之間無(wú)明顯差異。
　　 4、海馬組織GCLCmRNA及蛋白的表達(dá)
　　 4.1、海馬組織GCLCmRNA及蛋白的表達(dá)
　　 與正常對(duì)照組（1±0）相比，糖尿病對(duì)照組（0.642±0.118）、糖尿病鹽水組（0.660±0.123）海馬GCLMmRNA的表達(dá)顯著降低(P＜0.05);糖尿病對(duì)照組與糖尿病鹽水組間無(wú)顯著差異（

11、P＞0.05）。與糖尿病對(duì)照組及糖尿病鹽水組相比，α-硫辛酸干預(yù)組（1.245±0.128）與曲克蘆丁干預(yù)組（1.181±0.131）海馬GCLMmRNA的表達(dá)顯著增高(P＜0.05);α-硫辛酸干預(yù)組與曲克蘆丁干預(yù)組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。
　　 4.2、海馬組織GCLC蛋白的表達(dá)
　　 與正常對(duì)照組（1±0）相比，糖尿病對(duì)照組（0.989±0.002）、糖尿病鹽水組（0.989±0.001）海馬GCLC蛋白水平顯

12、著降低(P＜0.05);糖尿病對(duì)照組與糖尿病鹽水組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。與糖尿病對(duì)照組及糖尿病鹽水組相比，α-硫辛酸干預(yù)組（1.009±0.003）與曲克蘆丁干預(yù)組（1.002±0.001）海馬GCLC蛋白水平顯著增高（P＜0.05）;α-硫辛酸干預(yù)組蛋白表達(dá)高于曲克蘆丁干預(yù)組(P＜0.05)。
　　 5、海馬組織中SOD活性及MDA、GSH含量測(cè)定
　　 5.1、SOD活性(U/mgprot)
　　 與

13、正常對(duì)照組（115.976±7.581）相比，糖尿病對(duì)照組（61.806±3.942）、糖尿病鹽水組（68.237±7.632）海馬SOD活性明顯降低（P＜0.05）;糖尿病對(duì)照組與糖尿病鹽水組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。與糖尿病對(duì)照組及糖尿病鹽水組相比，α-硫辛酸干預(yù)組（200.331±6.181）與曲克蘆丁干預(yù)組（191.985±11.421）海馬SOD活力明顯升高（P＜0.05），并且高于正常對(duì)照組(P＜0.05);α-硫辛酸干

14、預(yù)組與曲克蘆丁干預(yù)組間無(wú)顯著差異（P＞0.05)。
　　 5.2、MDA含量(nmol/mgprot)
　　 與正常對(duì)照組（2.737±0.208）相比，糖尿病對(duì)照組（3.841±0.109）、糖尿病鹽水組(3.722±0.196)海馬MDA含量明顯升高（P＜0.05）;糖尿病對(duì)照組與糖尿病鹽水組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。與糖尿病對(duì)照組及糖尿病鹽水組相比，α-硫辛酸干預(yù)組（2.022±0.228）與曲克蘆丁干預(yù)組（2

15、.534±0.197）海馬MDA含量明顯降低(P＜0.05);曲克蘆丁干預(yù)組與正常對(duì)照組間無(wú)顯著性差別(P＞0.05)，α-硫辛酸干預(yù)組海馬MDA含量低于曲克蘆丁干預(yù)組及正常對(duì)照組(P＜0.05)。
　　 5.3、GSH含量(mg/gprot)
　　 糖尿病對(duì)照組（2.117±0.158）和糖尿病鹽水組（2.114±0.150）均低于正常對(duì)照組（2.657±0.207）（P＜0.01）;糖尿病對(duì)照組和糖尿病鹽水組相比無(wú)統(tǒng)

16、計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);α-硫辛酸干預(yù)組（4.337±0.174）和曲克蘆丁干預(yù)組（3.634±0.177）與糖尿病對(duì)照組和糖尿病鹽水組相比均增高(P＜0.01);α-硫辛酸干預(yù)組高于曲克蘆丁干預(yù)組(P＜0.01)。
　　 6、HE染色結(jié)構(gòu)
　　 正常對(duì)照組大鼠海馬椎體細(xì)胞元排列整齊，形態(tài)完整;糖尿病對(duì)照組及糖尿病鹽水組細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞膜及核仁模糊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，核固縮，細(xì)胞質(zhì)減少;α-硫辛酸干預(yù)組及曲克蘆丁干預(yù)組

17、較糖尿病對(duì)照組及糖尿病鹽水組上述改變明顯減輕。
　　 結(jié)論:
　　 1、STZ糖尿病大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降;與學(xué)習(xí)記憶密切相關(guān)的海馬組織中:重要的抗氧化物質(zhì)SOD、GSH顯著減低，合成GSH的關(guān)鍵酶GCLC、GCLM的表達(dá)亦減少;氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生增加。
　　 2、α-硫辛酸可改善STZ糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，提高海馬組織中SOD、GSH及GCLC、GCLM的表達(dá)，降低MDA的生成。
　　 3、