丁苯酞對STZ糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙及AMPA受體表達(dá)的影響.pdf

1、目的:認(rèn)知功能障礙是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，其主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)、記憶能力的下降。海馬的突觸可塑性是學(xué)習(xí)、記憶形成的分子基礎(chǔ)，而α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑-丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa-zolep-propionate receptor.，AMPAR)是調(diào)節(jié)突觸可塑性的重要因子。AMPAR數(shù)量及傳導(dǎo)效能的改變可直接影響學(xué)習(xí)記憶能力。丁苯酞因其神經(jīng)保護(hù)作用已廣泛應(yīng)用于缺血性腦血管病。

2、本實(shí)驗(yàn)旨在通過對鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)糖尿病大鼠預(yù)防性應(yīng)用丁苯酞，觀察其對糖尿病認(rèn)知功能障礙及AMPAR表達(dá)的影響。
　　方法:
　　1、制備STZ糖尿病大鼠模型及分組
　　55只健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(體重110g～130g)，隨機(jī)分為正常對照組(NC組，n=10只)和糖尿病組(DM，n=45只)。STZ糖尿病大鼠模型的制備:給予糖尿病大鼠一次性腹腔注射鏈脲佐菌素

3、60mg/kg，72h后測尾靜脈血糖，若血糖≥16.7mmol/L，則納入STZ糖尿病大鼠組。將造模成功的STZ大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組(DC，n=15)，糖尿病丁苯酞低劑量組(DL，n=15)，糖尿病丁苯酞高劑量組(DH，n=15)。
　　2、藥物干預(yù)
　　造模成功后第一天，給予DL組、DH組大鼠溶解于玉米胚芽油的丁苯酞灌胃，劑量分別為DL(60mg/Kg/d)、DH(120mg/Kg/d)，NC組及DC組用等量玉米胚芽油

4、灌胃，每日1次，連續(xù)12周。
　　3、一般情況觀察
　　每周檢測大鼠的血糖及體重情況。同時(shí)記錄大鼠精神狀態(tài)、毛發(fā)色澤及飲食、尿量等一般情況。
　　4、行為學(xué)檢測
　　各組大鼠于丁苯酞干預(yù)12周后進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，首先連續(xù)5天行定位航行實(shí)驗(yàn)，記錄逃避潛伏期;再于第6天行空間探索實(shí)驗(yàn)，讓其自由游泳60s，記錄60s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)。
　　5、觀察指標(biāo)
　　水迷宮結(jié)束后第1天處死大鼠，取大鼠海馬組

5、織，經(jīng)HE染色觀察海馬組織形態(tài);行RT-PCR檢測AMPAR的mRNA水平;應(yīng)用免疫組織化學(xué)分析、蛋白免疫印跡法(Western-blot)檢測細(xì)胞AMPAR的蛋白水平的表達(dá)。
　　6、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
　　應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析、重復(fù)測量數(shù)據(jù)多重比較配對的t檢驗(yàn)法（Bonferroni法）及多元方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)

6、學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、一般情況觀察
　　1.1一般狀態(tài)
　　NC組大鼠精神狀態(tài)良好、反應(yīng)靈敏、色澤光亮、進(jìn)食水及尿量正常，體重穩(wěn)定增長;DC組、DH組和DL組大鼠則出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍、毛發(fā)稀疏枯黃、多尿多飲、體型瘦弱及體重下降等現(xiàn)象。
　　1.2血糖
　　NC組大鼠血糖正常;DC組、DH組和DL組大鼠血糖明顯升高(＞20.0mmol/l)。
　　造模前，NC組與DC組大鼠血糖均正常，

7、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.20±0.54 vs7.19±0.68，P＞0.05);大鼠體重差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(131.67±4.85 vs133.05±4.39, P＞0.05)。
　　造模成功后12W末，與NC組相比，DC組、DH組和DL組大鼠血糖均顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(7.42±0.65 vs31.21，28.67±1.95，29.54±2.69，P＜0.01);體重則明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(345.23±5.57vs2

8、32.34±12.96，246.14±13.87，244.52±14.40，P＜0.01)。但DC組、DH組和DL組各組間的血糖及體重相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05）。
　　2、行為學(xué)測試結(jié)果
　　2.1基礎(chǔ)游泳速度
　　為排除大鼠的個(gè)體差異，在水迷宮測試前，讓其自由游泳60S，了解各組大鼠的基礎(chǔ)游泳速度，結(jié)果顯示各組大鼠基礎(chǔ)游泳速度間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　2.2定位航行實(shí)驗(yàn)
　　2.2

9、.1測試第1天各組大鼠逃避潛伏期未見明顯差異（P＞0.05）。
　　2.2.2測試第2-5天
　　與NC組相比，DL組、DH組及DC組逃避潛伏期延長(P＜0.05）;
　　與DC組相比，DL組、DH組逃避潛伏期縮短(P＜0.05）;
　　與DL組相比，DH組逃避潛伏期縮短(P＜0.05)。
　　NC組、DH組及DL組不同天數(shù)的潛伏期有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，趨勢為:第1天＞第2天＞第3天＞第4天＞第5天，天數(shù)和分組之間

10、不存在交互作用(P＜0.05)。DC組不同天數(shù)的潛伏期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.3空間探索實(shí)驗(yàn)
　　四組大鼠間比較，穿越平臺(tái)次數(shù)依次減少:
　　NC組＞DH組＞DL組＞DC組。
　　3、HE染色結(jié)果
　　正常對照組大鼠海馬CA1區(qū)未觀察到病理性改變，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，核大而圓;糖尿病組神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，數(shù)目減少，出現(xiàn)空泡變性，細(xì)胞核固縮等。丁苯酞治療組細(xì)胞改變較糖尿病對照組

11、減輕，且丁苯酞高劑量組較丁苯酞低劑量組改變明顯。
　　4、Rt-PCR結(jié)果
　　四組間比較，海馬AMPAR的mRNA表達(dá)量依次減少:
　　NC組＞DH組＞DL組＞DC組。
　　5、Western blot結(jié)果
　　DC組DH組和DL組的AMPAR蛋白表達(dá)量低于NC組(P＜0.05），且DH組和DL組的AMPAR蛋白表達(dá)量與DC組相比均增高(P＜0.05);其中，DH組的AMPAR蛋白表達(dá)量較DL組更加顯著(

12、P＜0.05）。
　　6、免疫組化結(jié)果
　　DM組海馬AMPAR細(xì)胞的表達(dá)量較NC組降低(P＜0.05)，DH組和DL組的AMPAR細(xì)胞的表達(dá)量均較DC組增高(P＜0.05);DH組的AMPAR細(xì)胞表達(dá)量高于DL組(P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1、STZ糖尿病大鼠成模12周時(shí)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降;且海馬組織中AMPAR表達(dá)下降。
　　2、應(yīng)用丁苯酞能改善STZ糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，