預(yù)防性應(yīng)用曲克蘆丁對(duì)STZ糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙及海馬Nrf2表達(dá)的影響.pdf

1、目的:隨著人們生活方式的改變和人口老齡化，糖尿病的發(fā)病率正在急劇上升。糖尿病可以合并多種并發(fā)癥，對(duì)糖尿病合并認(rèn)知功能障礙的研究也越來(lái)越受到重視。氧化應(yīng)激是糖尿病認(rèn)知功能障礙發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制。核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid-2-related factor2，Nrf2)是抗氧化應(yīng)激的核心轉(zhuǎn)錄因子。早期預(yù)防治療糖尿病認(rèn)知功能障礙，可以延緩和減少癡呆的發(fā)生，提高糖尿病患者的生活質(zhì)量。故本文通過(guò)對(duì)Nr

2、f2與糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙關(guān)系的分析，探討曲克蘆丁早期干預(yù)對(duì)預(yù)防糖尿病認(rèn)知功能障礙的依據(jù)。
　　方法:
　　1.制備STZ糖尿病大鼠模型及分組:
　　健康雄性(Sprague-Dawley, SD)大鼠40只(鼠齡6-8w)，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(NC組，n=10只)，糖尿病組（n=30只），糖尿病組大鼠空腹過(guò)夜后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素60mg/kg，72h后于尾靜脈測(cè)隨機(jī)血糖，血糖≥16.7mmol/L視為造模成功

3、。成模后將糖尿病組大鼠隨機(jī)分為糖尿病對(duì)照組（DC組，n=15），糖尿病曲克蘆丁干預(yù)組（DT組，n=15）。
　　2.干預(yù):
　　動(dòng)物成模后，給予DT組腹腔注射曲克蘆丁（60mg/kg）、DC組和NC組腹腔注射等量生理鹽水每日注射1次，歷時(shí)12周。
　　3.一般情況觀察:
　　觀察并記錄大鼠精神狀態(tài)及進(jìn)食、飲食、尿量等一般情況，檢測(cè)并記錄血糖、體重變化。
　　4.行為學(xué)檢測(cè):
　　各組大鼠于成模12周后

4、分別進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括前5天的定位航行實(shí)驗(yàn)以記錄逃避潛伏期及第6天的空間探索實(shí)驗(yàn)以記錄60s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)。
　　5.制備標(biāo)本及觀察指標(biāo):
　　水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束的第二天，將大鼠處死，斷頭、取海馬組織以測(cè)定超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活力、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，用基因?qū)崟r(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(R-T PCR)法檢測(cè)Nrf2的mRNA水平以，用蛋

5、白免疫印跡(Western-blot)法檢測(cè)細(xì)胞Nrf2蛋白的表達(dá)，包括細(xì)胞內(nèi)總蛋白和核內(nèi)蛋白，用免疫組化法測(cè)定海馬組織中Nrf2的表達(dá)水平。
　　6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　通過(guò)SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，重復(fù)測(cè)量方差分析（逃避潛伏期數(shù)據(jù)）統(tǒng)計(jì)，使用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)多重比較配對(duì)的t檢驗(yàn)法(Bonferroni法)，可進(jìn)行每個(gè)分組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)上作用的兩兩比較，使用多元方差分析的方法，可進(jìn)行每個(gè)

6、時(shí)間點(diǎn)上每個(gè)分組之間作用的兩兩比較。因數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布（P＞0.1），故應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果，應(yīng)用P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.一般情況觀察NC組大鼠血糖正常、體重穩(wěn)定增長(zhǎng)、皮毛光亮、反應(yīng)靈敏等。DC組大鼠血糖明顯升高(＞20.0mmol/L)，具備糖尿病的典型癥狀如多尿、多飲、多食等，逐漸出現(xiàn)皮毛枯黃、生長(zhǎng)緩慢、消瘦、反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象。干預(yù)過(guò)程中，DT組大鼠血糖升高(＞20.0mmol/L)，消

7、瘦情況與DC組相比差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，反應(yīng)較DC組靈敏。
　　2.Morris水迷宮結(jié)果
　　2.1 基礎(chǔ)游泳速度:各組大鼠游泳速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.2 定位航行實(shí)驗(yàn):
　　各組間的區(qū)別:與NC組相比，DC組逃避潛伏期延長(zhǎng)(P＜0.01)，提示成模后12周，糖尿病大鼠出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙;與DC組相比，DT組逃避潛伏期縮短(P＜0.01)，提示曲克蘆丁干預(yù)12周后，可減輕認(rèn)知功能障礙。
　　

8、第1天中NC組、DC組、DT組逃避潛伏期沒(méi)有明顯區(qū)別(P＞0.05);第2到5天，與NC組相比，DC組大鼠逃避潛伏期均延長(zhǎng)(P均＜0.01);第2天，DC組與DT組逃避潛伏期沒(méi)有明顯區(qū)別(P＞0.05);第3到5天，DT組逃避潛伏期較DC組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P均＜0.01）。
　　第5天與第1天逃避潛伏期的變化:NC組逃避潛伏期明顯縮短（P＜0.01);DC組逃避潛伏期無(wú)明顯變化（P＞0.05）;DT組，逃避潛伏期縮短(P＜

9、0.05)，提示曲克蘆丁干預(yù)12周后，可減輕認(rèn)知功能障礙。
　　2.3 空間探索實(shí)驗(yàn):
　　與NC組相比，DC組、DT組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P＜0.01);與DC組相比，DT組大鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)增加(P＜0.01)。
　　3.海馬組織HE染色結(jié)果NC組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊;DC組細(xì)胞排列紊亂，胞體縮小，胞質(zhì)紅色，正常形態(tài)神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯減少。DT組細(xì)胞形態(tài)正常，排列較整齊，結(jié)構(gòu)較為完整。<

10、br>　　4.免疫組化結(jié)果與NC組相比，DC組、DT組海馬Nrf2陽(yáng)性細(xì)胞的OD值均降低(P＜0.01);DT組的Nrf2陽(yáng)性細(xì)胞的OD值與DC組相比增高(P＜0.01)。
　　5.Rt-PCR結(jié)果與NC組相比，DC組、DT組海馬Nrf2mRNA表達(dá)量均降低(P＜0.01);DT組的Nrf2mRNA表達(dá)量均比DC組增高(P＜0.01)。
　　6.Western blot結(jié)果
　　6.1 細(xì)胞Nrf2總蛋白的表達(dá):

11、>　　與NC組相比，DC組、DT組的Nrf2總蛋白表達(dá)量均降低(P＜0.01);DT組的Nrf2總蛋白表達(dá)量與DC組相比增高(P＜0.01)。
　　6.2 細(xì)胞Nrf2核蛋白的表達(dá):
　　相對(duì)于NC組，DC組、DT組的Nrf2核蛋白表達(dá)量均降低(P＜0.01);DT組的Nrf2核蛋白表達(dá)量與DC組相比增高(P＜0.01)。
　　7.SOD和MDA結(jié)果:
　　SOD活力:DC組SOD活力弱于NC組(P＜0.05);

12、DT組與NC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05); DT組與DC組相比增強(qiáng)(P＜0.05)。
　　MDA含量:DC組的MDA含量高于NC組（P＜0.01）;DT組與NC組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);DT組的MDA含量與DC組相比降低(P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1.認(rèn)知功能障礙的STZ糖尿病大鼠其SOD活力減弱，MDA含量增加，且大鼠海馬Nrf2表達(dá)下調(diào)。
　　2.預(yù)防性應(yīng)用曲克蘆丁可能通過(guò)上調(diào)STZ糖尿病大鼠