AGEs抑制STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎臟D1受體表達及功能的研究.pdf

1、由腎臟近曲小管(renal proximal tubular，RPT)分泌的多巴胺作為內(nèi)源性排鈉利尿激素，在鈉負荷時負責(zé)超過60％的鈉排泄。多巴胺主要通過位于近曲小管的多巴胺D1受體(Dopamine D1 Receptors，D1R)發(fā)揮作用，D1R興奮通過抑制鈉泵如Na+-K+-ATPase的活性從而達到排鈉利尿的作用。研究表明D1R激動劑不能刺激糖尿病大鼠鈉排泄，原因是D1R表達和功能降低，鈉泵活性增加，從而導(dǎo)致鈉水潴留。糖尿病D

2、1R表達和功能的降低仍不十分清楚，有學(xué)者報道STZ或者四氧嘧啶誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腦組織中D1R表達降低，抑制氧化應(yīng)激能恢復(fù)腎臟D1R的功能。
　　 晚期糖基化終術(shù)產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)是蛋白質(zhì)的氨基酸、還原糖的醛基之間發(fā)生非酶促糖基化反應(yīng)的終產(chǎn)物，AGEs的形成過程是糖化和氧化的共同過程；由于腎臟結(jié)構(gòu)和功能的原因，AGEs易沉積與腎臟并誘發(fā)腎臟損傷。氧化應(yīng)激相關(guān)疾病如糖尿病

3、、高血壓、衰老均表現(xiàn)為機體AGEs水平增加，然而值得注意的是上述疾病均表現(xiàn)為尿鈉排泄降低和鈉潴留，提示AGEs與D1R表達和功能之間的聯(lián)系，但是AGEs是否能降低D1R的表達和功能及與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系并不清楚。
　　 目的：
　　 研究AGEs對STZ-誘導(dǎo)糖尿病大鼠腎臟D1R表達和功能的影響，闡明糖尿病大鼠腎臟D1R功能降低的機理。
　　 方法：
　　 1.建立STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型：SPF級雄性S

4、D大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按35mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)連續(xù)3次，每周一次。最后一次STZ注射72h后測定空腹血糖，血糖值≥300mg/dL的大鼠選為糖尿病大鼠。正常組大鼠腹腔注射等劑量緩沖液。將糖尿病大鼠隨機分為模型組、Apocynin治療組(APO組)和氨基胍組(AG組)并設(shè)正常對照組，每組8只。APO組和AG組大鼠分別按照200mg/kg/d和100mg/kg/d劑量灌胃給藥，模型

5、組和正常組給予等體積蒸餾水灌胃，給藥時間為5周。每天記錄大鼠飲水量和進食量，每周記錄大鼠體重及血糖。于實驗結(jié)束前代謝籠收集24h尿液，并記錄尿量。全自動生化分析儀分析血清肌酐、尿素氮、尿蛋白等生化指標的變化；取腎皮質(zhì)于10％甲醛固定液中，制作病理切片，觀察AG和APO對糖尿病大鼠腎臟病變的影響。
　　 2.AGEs對糖尿病大鼠鈉潴留的影響：分組同上，于實驗結(jié)束前，將大鼠放入代謝籠中，收集24h尿液，并記錄尿量，連續(xù)2天，離心留取

6、1ml尿液上清。收集尿液后，進行鈉負荷實驗：給予含1％NaCl的飲用水，自由飲水，其他飼養(yǎng)條件不變，連續(xù)3天。然后，將大鼠放入代謝籠中，收集24h尿液，記錄尿量，留取1ml尿液上清。大鼠取血處死后，離心后取血清。將上述留取的尿液上清和血清用于檢測尿鈉濃度，研究抑制AGEs和氧化應(yīng)激對糖尿病大鼠鈉潴留的影響。
　　 3.AGEs對糖尿病大鼠腎臟多巴胺受體表達和功能的影響及其機理的研究：熒光法檢測血清和腎組織AGEs水平；化學(xué)發(fā)光法

7、檢測血清和腎組織超氧陰離子和NADPH氧化酶活性；Western blot檢測腎組織D1R的表達情況；ELISA法檢測腎近曲小管cAMP水平和AC活性；試劑盒檢測腎近曲小管Na+-K+-ATPase酶活性。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功構(gòu)建糖尿病大鼠模型：多次小劑量STZ注射后大鼠出現(xiàn)倦臥、神志萎靡、毛色枯黃、活動減少、及多飲、多食、多尿的表現(xiàn)，血糖值≥300mg/dL，并持續(xù)至實驗結(jié)束。實驗結(jié)果顯示模型組大鼠腎臟指數(shù)增

8、大，同時尿素氮、肌酐清除率等指標和24h尿蛋白量均明顯增高，病理切片見多數(shù)腎小球體積不同程度增大，腎小球毛細血管腔擴張，腎小球系膜區(qū)擴張，基底膜不同程度增厚，腎小管擴張明顯，上皮細胞水腫及破碎的程度加深。AG和APO降低腎臟指數(shù)、尿蛋白和肌酐清除率，改善了腎功能。因此，AGEs和氧化應(yīng)激促進糖尿病大鼠腎臟損傷。
　　 2.AGEs對糖尿病大鼠鈉潴留的影響：(1)模型組大鼠尿量較正常組顯著增高(P<0.01)，而尿鈉及尿鉀濃度低于

9、正常組(P<0.001)；鈉負荷后，模型組尿量高于鈉負荷前尿量(P<0.001)，表現(xiàn)多飲多尿現(xiàn)象，尿鈉濃度顯著升高，并且血鈉濃度高于正常組，表現(xiàn)出鈉潴留。(2)AG組和APO組大鼠尿量、尿鈉及尿鉀濃度較模型組高，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。鈉負荷后，AG組和APO組大鼠尿量明顯高于模型組(P<0.05)；并且該兩組大鼠的尿鈉濃度較模型組高(P<0.05)，血鈉濃度低于模型組(P<0.05)而高于正常組(P<0.05)，表現(xiàn)出促進尿

10、鈉排泄，改善了鈉潴留。
　　 3.AGEs抑制糖尿病大鼠腎臟多巴胺受體功能的機理研究：
　　 (1)模型組大鼠血清和腎組織AGEs水平升高，超氧陰離子和NADPH氧化酶活性增加，體內(nèi)的糖化和氧化過程增強。腎組織D1R的表達下降；同時基礎(chǔ)狀態(tài)cAMP水平和Fen刺激D1R后AC活性均降低；Na+-K+-ATPase活性增加。
　　 (2)AG組糖尿病大鼠血清和腎組織AGEs的水平降低，同時超氧陰離子和NADPH氧化

11、酶活性下降。APO也降低了糖尿病大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激。AG和APO均能使糖尿病大鼠D1R表達量增加，并且基礎(chǔ)狀態(tài)cAMP水平和Fenoldopam刺激腎近曲小管AC活性高于模型組大鼠，但仍低于正常組。另外AG和APO降低了糖尿病大鼠Na+-K+-ATPase酶活性，與模型組比較具有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。因此，AG和APO均降低體內(nèi)氧化應(yīng)激，增加D1R表達，從而提高Fen刺激的AC活性和Na+-K+-ATPase抑制作用的應(yīng)答性，降低N