ADSCs移植治療STZ誘導(dǎo)的SD大鼠1型糖尿病腎病的研究.pdf

1、前言：
　　 糖尿病(diabetesmellitus,DM)是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝性疾病群,其引起的慢性并發(fā)癥可遍及全身各重要器官。糖尿病腎病(diateticnephropathy,DN)是主要的微血管病變之一,25%-40%的糖尿病患者20年內(nèi)都會(huì)發(fā)生DN,是1型糖尿病(type1diabetesmellitus,T1DM)患者的主要死亡原因,己成為發(fā)達(dá)國(guó)家慢性腎衰竭的首要因素。
　　 DN的發(fā)病機(jī)制

2、非常復(fù)雜,尚未完全闡明。目前公認(rèn)的是糖、脂代謝紊亂及其導(dǎo)致的血流動(dòng)力學(xué)異常,兩者交互作用是DN發(fā)生的始動(dòng)因素。糖代謝增強(qiáng)導(dǎo)致的反應(yīng)性氧化應(yīng)激,巨噬細(xì)胞活化引起的慢性炎癥是DN發(fā)生發(fā)展的重要因素。腎小球高濾過(guò)和腎臟肥大是早期DN的特點(diǎn),繼續(xù)發(fā)展則出現(xiàn)基底膜增厚,腎小球系膜增生,微量白蛋白尿,腎臟的重度炎性反應(yīng),腎小球硬化和小管間質(zhì)纖維化等,導(dǎo)致終術(shù)期腎功能衰竭。
　　 目前對(duì)于DN尚缺乏有效的治療手段,臨床主要應(yīng)用改善血壓和控制血

3、糖的藥物治療,必要時(shí)進(jìn)行血液透析。這些療法均需終身性治療、費(fèi)用昂貴,治療效果不理想,只能減慢并不能阻止DN的進(jìn)程,不能起到保護(hù)腎臟和改善腎功等本質(zhì)性作用。細(xì)胞治療是指利用細(xì)胞的某種特性,采用細(xì)胞工程方法使這些細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)、殺滅病原體,促進(jìn)組織再生和機(jī)體康復(fù)等治療效果,目前已成為治療疾病的有效手段。但細(xì)胞種類的選擇很關(guān)鍵,干細(xì)胞因具有自我更新、定向分化及免疫調(diào)節(jié)能力,是理想的種子細(xì)胞來(lái)源。胚胎干細(xì)胞很難獲得大量可定向分化的純度較高的種

4、子細(xì)胞,又涉及倫理學(xué)問(wèn)題。因此目前真正用于組織構(gòu)建、器官修復(fù)和細(xì)胞治療的種子細(xì)胞仍然是自體來(lái)源的成體干細(xì)胞。
　　 骨髓干細(xì)胞(bone marrowme senehymal cells,BMSCs)和脂肪干細(xì)胞(adipose deried stem cells,ADSCs)是研究較多的成體問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞。ADSCs除具有與BMSCs一致的自我更新、多向分化和免疫調(diào)節(jié)等干細(xì)胞特性外,還具有單位體積組織內(nèi)干細(xì)胞含量大,取材簡(jiǎn)單安全

5、、痛苦小等優(yōu)點(diǎn)。脂肪組織分布廣泛,不同部位脂肪組織來(lái)源的ADSCs也不盡相同。腹壁皮下脂肪組織取材方便無(wú)危險(xiǎn),由此獲得的ADSCs具有明顯的干細(xì)胞生物學(xué)特性,增殖能力強(qiáng),具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。因此其作為ADSCs的代表,廣泛應(yīng)用在組織工程和細(xì)胞治療等領(lǐng)域。大量研究表明ADSCs可以向多種組織、細(xì)胞分化。數(shù)據(jù)顯示ADSCs經(jīng)基因改造技術(shù)、在化學(xué)藥物和細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下,均可分化為胰島素分泌細(xì)胞(Insulin producing cells,I

6、PCs)。但基因技術(shù)的致突變性和化學(xué)藥物的致毒性都限制其應(yīng)用于臨床,因此探討一種安全有效的誘導(dǎo)方式意義重大。
　　 研究表明BMSCs可以通過(guò)降低糖尿病大鼠的血糖,進(jìn)而改善和治療DN,而有關(guān)ADSCs對(duì)DN的治療尚未見(jiàn)報(bào)道。但研究顯示ADSCs可以通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)來(lái)減輕大鼠腎缺血再灌注的損傷,ADSCs還能通過(guò)分化途徑改善大鼠的急性腎衰竭、保護(hù)腎臟,ADSCs對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變也有改善和治療的作用。由此可見(jiàn)ADSC

7、s具有保護(hù)細(xì)胞免受損傷、促進(jìn)病變組織再生修復(fù)的重要作用。同時(shí),ADSCs及其分化的IPCs能降低糖尿病大鼠的血糖水平已被確認(rèn),結(jié)果顯示ADSCs具備治療DN的潛能,明確ADSCs對(duì)DN的治療效果及其作用機(jī)制意義重大。
　　 為了探討降糖作用對(duì)于DN的治療,是否具有主導(dǎo)地位,本實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)立了ADSCs與IPCs兩個(gè)治療組。IPCs屬于定向分化了的細(xì)胞,喪失了干細(xì)胞的生物學(xué)特性,只具有明顯的降糖作用,因而可以作為攜帶降糖作用的單一因

8、素,有助于明確干細(xì)胞治療DN的作用機(jī)制。因此,本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)腹腔注射鏈脲佐菌素(Strep to zotocin,STZ)制備大鼠DN模型,向DN大鼠體內(nèi)分別移植熒光標(biāo)記的ADSCs和IPCs,從腎臟的病理改變,血尿生化指標(biāo),氧化應(yīng)激指標(biāo),炎癥因子及MAPK通路蛋白的表達(dá)等方面進(jìn)行研究,比較ADSCs與IPCs對(duì)DN的改善及治療效果,探討應(yīng)用細(xì)胞治療DN可能的作用機(jī)制,為臨床治療DN提供新思路。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法：
　　

9、 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 (一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
　　 健康清潔級(jí)SD大鼠100只,體質(zhì)量250-300g,雌雄不限,由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　 (二)主要試劑
　　 低糖DMEM、高糖DMEM、胎牛血清(Gibco),CD31-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD49d-PE、CD106-PE單克隆抗體(eBioscience),Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、異丁基甲基黃嘌呤、地塞米松、胰島素、吲哚美辛

10、、β-甘油磷酸鈉、油紅O、L-脯氨酸、抗壞血酸、甲苯胺藍(lán)、STZ、PKH26(Sigma),GDF-5(PeproTeeh),細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(凱基生物),尼克酰胺、活化素A、GLP-1(RD),大鼠胰島素、C肽ELISA酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒(Mercodia),大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、MDA測(cè)定試劑盒(南京建成)。
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 (一)大鼠ADSCs的分離培養(yǎng)與鑒定
　

11、　 分離大鼠腹股溝皮下脂肪組織,培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞,相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),MTT法檢測(cè)P3、P6、P9、P15細(xì)胞的增殖活性,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和表面抗原的表達(dá)。成骨、成軟骨、成脂肪誘導(dǎo)后分別行茜素紅、甲苯胺藍(lán)和油紅O染色進(jìn)行鑒定。
　　 (二)體外誘導(dǎo)ADSCs分化為IPCs
　　 取P3的ADSCs接種到6孔板,分4組:NA,NG,AG,NAG;采用先高糖后低糖培養(yǎng)基的兩步誘導(dǎo)法培養(yǎng)。相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化,

12、雙硫腙染色鑒定IPCs內(nèi)的鋅離子,ELISA法檢測(cè)IPCs對(duì)胰島素及C-肽的分泌量,RT-PCR檢測(cè)IPCs對(duì)胰島β細(xì)胞相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。
　　 (三)ADSCs與IPCs移植治療大鼠DN
　　 STZ誘導(dǎo)SD大鼠制備DN模型,分別移植熒光標(biāo)記的ADSCs和IPCs。熒光顯微鏡觀察標(biāo)記細(xì)胞的定位,PAS染色檢測(cè)腎臟病理改變,檢測(cè)血尿生化指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎癥因子的表達(dá),WesternBlotting檢測(cè)超氧化物歧

13、化酶及MAPK通路蛋白的表達(dá)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 一、大鼠ADSCs的生物學(xué)特性
　　 SD大鼠的ADSCs類似成纖維細(xì)胞的長(zhǎng)梭形,呈漩渦狀生長(zhǎng)。MTT結(jié)果顯示ADSCs傳代培養(yǎng)P15后增殖能力仍未降低。細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ADSCs具有干細(xì)胞特性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,ADSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物CD90、CD44,不表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記CD31,低表達(dá)CD49d,不表達(dá)CD106。成骨誘導(dǎo)后鈣結(jié)節(jié)形

14、成,茜素紅染色陽(yáng)性;成軟骨誘導(dǎo)后分泌蛋白多糖,甲苯胺藍(lán)染色陽(yáng)性;成脂誘導(dǎo)后脂滴形成,油紅O染色陽(yáng)性。
　　 二、ADSCs誘導(dǎo)分化為IPCs
　　 ADSCs更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液后細(xì)胞增殖緩慢,誘導(dǎo)21d時(shí)NAG組的細(xì)胞能形成胰島樣細(xì)胞團(tuán),雙硫腙染色陽(yáng)性,并呈血糖濃度依賴性分泌胰島素及C肽。誘導(dǎo)14d時(shí)僅能檢測(cè)到PDXlmRNA,表明此時(shí)已分化出胰島前體細(xì)胞,誘導(dǎo)21d時(shí)NAG組細(xì)胞可表達(dá)GLUT1、INS、PDX1mRNA,

15、與正常大鼠胰島β細(xì)胞表達(dá)水平相近,明顯高于AG組。NAG組可以誘導(dǎo)ADSCs分化為有功能的IPCs。
　　 三、ADSCs與IPCs移植治療大鼠DN
　　 大鼠經(jīng)STZ注射12w后,血尿生化指標(biāo)發(fā)生明顯改變,符合DN模型標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)胞移植4w后檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ADSCs能改善腎功的生化指標(biāo),并修復(fù)腎組織的病理改變,IPCs對(duì)其改善并不明顯。ADSCs和IPCs都能下調(diào)血糖水平,增加胰島素分泌量。ADSCs能降低氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA和

16、蛋白質(zhì)羰基含量,下調(diào)MnSOD和CuZnSOD的表達(dá)。減少炎癥因子的分泌,抑制MAPK通路的激活。而IPCs不能抑制MAPK通路,對(duì)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)沒(méi)有明顯改善。
　　 結(jié)論：
　　 1.采用Ⅰ型膠原酶消化法成功培養(yǎng)ADSCs,穩(wěn)定增殖,表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)的表面抗原,具有成骨、成軟骨和成脂肪的多向分化潛能。
　　 2.尼克酰胺、活化素A和GLP-1能成功誘導(dǎo)ADSCs分化為有功能的IPCs。
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