Ion Torrent PGM_平臺二代測序技術(shù)在線粒體病診斷中的應(yīng)用.pdf

1、目的:線粒體疾病(mitochondrial diseases,MD)可累及多個系統(tǒng),臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣,既往乳酸測定、影像學(xué)、呼吸鏈酶學(xué)、sanger測序等檢測雖可以提示診斷,但缺乏足夠的靈敏度或特異度,為線粒體病的診斷帶來困難。二代測序(next generation sequencing,NGS)技術(shù)的出現(xiàn),使多種基因?qū)用娴奶剿鞒蔀榭赡堋１狙芯繑M利用Ion Torrent PGM TM測序技術(shù)對19例臨床上確診為線粒體病患兒進(jìn)行全線

2、粒體基因(mitochondrial DNA,mtDNA)及97條復(fù)合體I(complex I,CI)相關(guān)核基因(nuclear DNA,nDNA)測序檢查,尋找相關(guān)突變,探討Ion Torrent PGM TM平臺二代測序技術(shù)應(yīng)用于線粒體病的基因診斷價值。
　　方法:收集2011年10月~2013年5月就診于首都兒科研究所神經(jīng)內(nèi)科的疑似MD患兒,經(jīng)監(jiān)護(hù)人知情同意后,予以呼吸鏈酶活性檢測發(fā)現(xiàn)異常確診為MD患兒19例。取患兒全血樣本

3、,提取白細(xì)胞中DNA,采用PCR反應(yīng)進(jìn)行mtDNA擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物定量混合制備文庫,在Ion Torrent PGM TM上完成全測序檢測。其中酶學(xué)檢測復(fù)合體I異常的病例13例血樣本再進(jìn)行復(fù)合體I相關(guān)的97個nDNA測序。所得數(shù)據(jù)使用Ion Reporter等軟件進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:(1)19例MD患者線粒體全基因組測序結(jié)果分析共產(chǎn)生8.127×106個堿基數(shù)據(jù),其中有8.082×106個堿基可以定位到參考序列上,定位率為99.4

4、％。(2)13例CI相關(guān)核基因組97條基因測序結(jié)果分析共得到3.095×106個堿基數(shù)據(jù),其中有 2.903×106個堿基可以定位到參考序列上,定位率為 93.8%。(3)利用Ion Torrent PGM自帶Torrent Suite 4.0.2軟件包及Torrent Browser軟件分析樣本序列中變異位點,共檢出2357個變異位點(其中mtDNA全測序數(shù)據(jù)得出849個變異位點,而1508個變異位點位于CI相關(guān)97條nDNA上)。利

5、用IgV軟件通過質(zhì)量控制的變異位點有1625個(其中mtDNA全測序數(shù)據(jù)有510個,CI相關(guān)nDNA測序數(shù)據(jù)有1115個)。重點分析mtDNA上變異位點,檢索mitomap、Google學(xué)術(shù)搜索引擎相對比得到既往文獻(xiàn)報道與MD致病相關(guān)的 mtDNA變異位點 5 個,分別為 A5514G、T12811C、T14502C、T14502C、G15927A,其中T14502C、G15927A與MD基因致病相關(guān)性更大。新發(fā)現(xiàn)變異位點13個。

6、>　　結(jié)論:(1) 本實驗測序發(fā)現(xiàn) mtDNA5 個變異位點:A5514G、T12811C、T14502C、A15924G、G15927A與MD致病相關(guān),其中T14502C有助于早期診斷Leber遺傳性視神經(jīng)病,G15927A與MD基因致病相關(guān)性更大。 (2)本實驗新發(fā)現(xiàn)變異位點13個,與MD致病相關(guān)性尚待進(jìn)一步研究驗證。(3) Ion Torrent PGM TM平臺的二代測序技術(shù)具有靈敏度高、快速、高性價比的優(yōu)點,在檢測線粒體病突變