基于二代測(cè)序技術(shù)對(duì)智力障礙的發(fā)病機(jī)制及診斷策略研究.pdf

1、背景:智力障礙(ID)，又稱為智力低下、精神發(fā)育遲滯(MR)、腦發(fā)育遲緩(DD)，以認(rèn)知功能和社會(huì)適應(yīng)功能的缺陷為主要臨床特征，通常在18歲前發(fā)病。腦發(fā)育遲緩豐要用于5歲以下的嬰幼兒的診斷，指患兒在適應(yīng)性、大運(yùn)動(dòng)、精細(xì)運(yùn)動(dòng)、語言、個(gè)人社交五個(gè)發(fā)育能區(qū)中兩個(gè)或兩個(gè)以上發(fā)育能區(qū)較同齡兒明顯落后（≥2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差）。智商(IQ)是評(píng)估認(rèn)知功能的指標(biāo)，IQ分?jǐn)?shù)低于70被視為認(rèn)知功能缺陷。智力障礙是嚴(yán)重的社會(huì)問題，群體發(fā)病率為1％-3％，男性與女性患

2、者的比例約為1.4～1.6∶1。ID臨床表現(xiàn)多樣化，認(rèn)知障礙可以是唯一的癥狀，也可伴隨其他多系統(tǒng)異常，如先天畸形及神經(jīng)系統(tǒng)異常癥狀。ID病因復(fù)雜，既有內(nèi)在的遺傳岡素也有外在的環(huán)境因素，約有2/3的ID是由遺傳因素導(dǎo)致，包括各類染色體異常、單基因或多基因突變及先天性代謝缺陷病等。目前對(duì)于智力障礙的診斷主要依賴臨床表現(xiàn)與常規(guī)臨床檢驗(yàn)以及傳統(tǒng)的遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)，如染色體核型分析、PCR-Sanger測(cè)序、熒光原位雜交(FISH)及多重連接探針擴(kuò)

3、增技術(shù)(MLPA);但是，仍有半數(shù)以上的ID患者未能明確病因。近年來研究顯示基因拷貝數(shù)變異（CNVs）與神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知障礙類疾病密切相關(guān)，如智力障礙及自閉癥譜系障礙;因此有研究應(yīng)用微陣列比較基因組雜交（aCGH）和單核苷酸多態(tài)性分型為基礎(chǔ)的陣列技術(shù)(SNParray)在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行CNVs分析;但是該方法不能檢測(cè)無CNVs改變的其他遺傳變異，例如點(diǎn)突變。二代測(cè)序技術(shù)以高效、快速、特異、靈敏等眾多優(yōu)勢(shì)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用飛速發(fā)展，為遺傳性

4、疾病的病因研究帶來了巨大的變革，可以檢測(cè)點(diǎn)突變、堿基的缺失或插入等;國(guó)外已有少量研究，利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)ID進(jìn)行病因研究，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)單基因點(diǎn)突變是導(dǎo)致智力障礙的重要原因;國(guó)內(nèi)目前僅有針對(duì)ID基因突變的個(gè)例報(bào)道，尚未見到應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)大樣本ID患者進(jìn)行多基因、系統(tǒng)性發(fā)病機(jī)制研究。本研究創(chuàng)新性的利用日標(biāo)序列捕獲-二代測(cè)序技術(shù)對(duì)40例ID患者的384個(gè)ID相關(guān)基因進(jìn)行序列分析，并在拷貝數(shù)變異熱點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)若干捕獲探針，檢測(cè)與智力障礙相關(guān)

5、的CNVs。由于ID的病因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣化，為疾病診斷帶來困難，而國(guó)內(nèi)卻缺乏規(guī)范細(xì)致的診斷流程，迫切需要建立一個(gè)切實(shí)有效的智力障礙診斷策略。
　　目的:通過對(duì)160例智力障礙患者的病因分析，研究ID的發(fā)病機(jī)制，為遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷、治療與預(yù)后提供理論依據(jù)。通過對(duì)病例的綜合分析，建立一種切實(shí)有效的智力障礙診斷策略，為優(yōu)化診斷流程并提高診斷率服務(wù)。
　　方法:對(duì)160例智力障礙患者進(jìn)行詳細(xì)的病史采集、體格檢查、常規(guī)檢驗(yàn)、影像

6、學(xué)檢查及IQ值的測(cè)定，由外在環(huán)境因素導(dǎo)致的ID可初步診斷，非外在因素引起ID進(jìn)行常規(guī)遺傳學(xué)檢查(包括:染色體核型分析、遺傳代謝病篩查、脆性X綜合征三核苷酸(CGG)重復(fù)序列分析、亞端?？截悢?shù)變異分析)后仍不能明確病因者，采用目標(biāo)序列捕獲-二代測(cè)序技術(shù)對(duì)其中40例患者的384個(gè)已知智力障礙相關(guān)基因進(jìn)行深度測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析、核苷酸的插入或缺失(InDel)分析和外顯子大片段缺失/重復(fù)分析，最終篩選出與疾病相關(guān)的

7、候選SNPs、InDels及外顯了大片段缺失/重復(fù);利用Sanger一代測(cè)序?qū)λ械暮蜻xSNPs、InDels進(jìn)行驗(yàn)證，利用MLPA技術(shù)對(duì)大片段的缺失/重復(fù)進(jìn)行驗(yàn)證;為了分析基因突變的來源及遺傳機(jī)制，對(duì)部分家系進(jìn)行了相關(guān)序列分析。
　　結(jié)果:通過對(duì)160例智力障礙患者的病因分析及常規(guī)遺傳學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)160例患者中，由非環(huán)境因素導(dǎo)致的ID患者84例，其中21-三體綜合征2例(2/84，2.38％)，甲基丙二酸血癥1例(1/84，1.

8、19％)，亞端?？截悢?shù)變異7例(7/84，8.33％)。采用目標(biāo)序列捕獲-二代測(cè)序技術(shù)對(duì)40例經(jīng)過常規(guī)遺傳學(xué)檢測(cè)仍未能明確診斷的ID患者進(jìn)行了384個(gè)已知智力障礙相關(guān)基因的深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)2例患者(2/40，5％)存在大片段拷貝數(shù)缺失，包括7q11.23和22q11.21缺失;20例患者(20/40，50％)存在致病性單基因或多基因突變，包括22個(gè)錯(cuò)義突變，2個(gè)剪切突變，2個(gè)InDel，陽性檢出率達(dá)55％;其巾23個(gè)突變?yōu)閲?guó)內(nèi)外首次報(bào)道的

9、新發(fā)突變，所有錯(cuò)義突變及InDels均導(dǎo)致保守的氨基酸殘基發(fā)生改變，經(jīng)SIFT、PolyPhen2軟件預(yù)測(cè)或MutationT@ster軟件預(yù)測(cè)突變潛在致病。根據(jù)ID患者的病因分析及遺傳檢測(cè)結(jié)果，總結(jié)出一套實(shí)用有效的智力障礙診斷策略，為臨床快速的病因診斷服務(wù)。
　　結(jié)論:本研究結(jié)果顯示影響編碼區(qū)的單基因或多基因突變是智力障礙的常見病因;目標(biāo)序列捕獲-二代測(cè)序技術(shù)可以作為一種高效特異的檢測(cè)方法為智力障礙患者提供快速有效的病因診斷，為