基于二代測序技術(shù)的視網(wǎng)膜遺傳疾病分子診斷研究.pdf

1、視網(wǎng)膜遺傳疾病是一組常見的致盲性視網(wǎng)膜疾病，具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性。視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)和Leber先天性黑朦癥(Lebercongenital amaurosis，LCA)是兩種主要的遺傳性視網(wǎng)膜疾病，全世界約有近2，000，000患者患有該類疾病。
　　視網(wǎng)膜遺傳疾病的遺傳機制復(fù)雜，臨床表現(xiàn)多樣且不具有特異性，基于臨床表現(xiàn)進(jìn)行的診斷難以準(zhǔn)確對疾病的種類和發(fā)病機制進(jìn)行鑒定。近年來，

2、以基因檢測為基礎(chǔ)的分子診斷技術(shù)逐步應(yīng)用于在臨床，實踐表明其有較好的輔助診斷效果。目前，分子診斷的主要方法為Sanger測序法和APEX法。此兩種方法具有準(zhǔn)確性高、檢測快速的特點，但缺點在于僅能檢測已知突變位點，且檢測費用高。而近年發(fā)展起來的二代測序技術(shù)(Next generation sequencing，NGS)以其測序高通量、范圍廣、低消耗的特點備受青睞。同時目的基因獲取(Capture)技術(shù)的發(fā)展，更加有效地降低NGS對單個樣品進(jìn)

3、行檢測的成本。
　　本課題應(yīng)用capture-NGS技術(shù)，采用分步研究策略對來自世界不同地區(qū)、不同種族背景的553名視網(wǎng)膜遺傳疾病患者（主要包括高加索人和中國人）的血液樣本進(jìn)行DNA測序。經(jīng)DNA提取、DNA片段化、文庫制備、Capture后，完成質(zhì)量評價，最終進(jìn)行序列測定。使用自主設(shè)計的測序分析平臺（包括已知的全部視網(wǎng)膜疾病基因）對DNA序列進(jìn)行分析比對，獲得突變位點信息。隨后，利用Sanger測序法驗證潛在的突變位點并完成分離

4、實驗，結(jié)合患者的相關(guān)臨床信息，確定致病突變。經(jīng)過分析確定331例先證者的潛在致病突變，獲得解率為60.0％。其中194個先證者被確定帶有RP致病基因，54個被確定帶有LCA致病基因。高加索人和中國人RP的致病突變解率相近約為65％，而中國人LCA的致病突變解率(75.0％)要明顯高于高加索人(66.7％)。在已解決的病例中，共確定了82個基因的538個致病突變（含401個新發(fā)現(xiàn)的突變），其中61％為錯義突變。研究發(fā)現(xiàn)USH2A、ABCA

5、4、EYS、CRB1、GUCY2D為中國視網(wǎng)膜遺傳疾病患者的高頻突變基因，其中USH2A錯義突變位點c.T2802G(p.C934W)為中國RP患者的高頻突變位點。而在美國邁阿密地區(qū)人群中，PRPF31基因突變是該地區(qū)西班牙裔美國人中發(fā)生最頻繁的突變，且該基因的變異表現(xiàn)出不完全外顯現(xiàn)象和性別偏好性。特別的是，在BLM043、BLM067、BLM101三個病例中同時發(fā)現(xiàn)c.322+4_322+7del變異。我們還確定一例先證者所攜帶新生的

6、SNRNP200突變，并發(fā)現(xiàn)4名先前被診斷為RP的患者帶有非RP致病基因（WDR19，CHM，C210RF2和IMPG1），繼而對其進(jìn)行臨床重新評估。
　　綜上，本研究應(yīng)用capture-NGS技術(shù)的基因檢測方法，實現(xiàn)了對網(wǎng)膜遺傳疾病患者致病基因大范圍、高通量、低消耗的序列測定與分析。并且通過對不同地區(qū)和人群的視網(wǎng)膜遺傳疾病患者致病基因的序列和突變位點鑒定，首次報道了西班牙裔美國人RP患者的致病基因突變譜特征。這些研究豐富了視網(wǎng)膜