二代基因測(cè)序技術(shù)在兒童遺傳性難治性溶血性貧血中的應(yīng)用研究.pdf

1、研究目的:通過對(duì)38例溶血性貧血(Hemolytic Anemia，HA)患兒進(jìn)行病因?qū)W分析，研究兒童HA的病因及發(fā)病機(jī)制，為難治性溶血性貧血病因診斷、疾病治療及預(yù)后指導(dǎo)提供理論依據(jù)。并通過對(duì)特殊病例的進(jìn)一步分析，為建立切實(shí)有效的遺傳性難治性溶血性貧血的診斷方法提供依據(jù)，為遺傳性難治性溶血性貧血的病因診斷提供優(yōu)化途徑。
　　研究方法:對(duì)2016年1月至2016年12月長海醫(yī)院住院的38例HA患兒進(jìn)行詳細(xì)的病史采集及體格檢查，并通過

2、常規(guī)檢查、抗人球蛋白試驗(yàn)（Coomb's試驗(yàn)）、骨髓穿刺術(shù)等相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查，初步對(duì)HA患兒病因進(jìn)行診斷。對(duì)常規(guī)檢查手段不能明確病因的患兒，行溶血疾病檢查對(duì)紅細(xì)胞膜、酶學(xué)及血紅蛋白進(jìn)行檢測(cè)，如仍病因不明或臨床反復(fù)發(fā)作的患兒，采用二代基因測(cè)序技術(shù)對(duì)其中15例患兒271個(gè)已知貧血相關(guān)基因及位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行核苷酸插入或缺失(insertionand deletion，InDel)分析和單核苷酸多態(tài)性(single nucleoti

3、de polymorphisms，SNP)分析，對(duì)篩選出的所有的與疾病相關(guān)的SNPs、lnDels使用Sanger一代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。同時(shí)，為了研究患兒突變基因來源和遺傳學(xué)機(jī)制，對(duì)部分貧血患兒針對(duì)該病進(jìn)行家系突變基因序列分析。
　　研究結(jié)果:通過對(duì)38例HA患兒進(jìn)行病因?qū)W分析及常規(guī)檢查、溶血疾病檢查發(fā)現(xiàn)，38例患兒中，由感染因素誘發(fā)溶血的患兒18例(18/38，47.4％，包括EB病毒感染2例，肺炎支原體感染2例)，自身免疫

4、性溶血性貧血(AIHA)患兒11例(11/38，28.9％)，紅細(xì)胞膜病6例(6/38,)，酶學(xué)異常1例(1/38，2.6％)，血紅蛋白病2例(2/38，5.3％％)。對(duì)15例通過常規(guī)檢查手段病因不明的遺傳性難治性溶血性貧血患兒采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)其271個(gè)已知貧血相關(guān)基進(jìn)行深度測(cè)序，發(fā)現(xiàn)11例患兒存在致病性單基因或多基因突變，突變位點(diǎn)包括12個(gè)錯(cuò)義突變，3個(gè)移碼突變，1個(gè)無義突變，陽性檢出率達(dá)73％;其中13個(gè)基因突變位點(diǎn)是國內(nèi)外文獻(xiàn)未

5、報(bào)道的新發(fā)突變位點(diǎn)，并且所有的突變位點(diǎn)都導(dǎo)致了保守的氨基酸殘基及序列發(fā)生改變。采用MaxEntSca0分析算法和程序，經(jīng)Provean、SIFT、Polyphen2、Mutationtaster軟件預(yù)測(cè)基因突變的潛在致病風(fēng)險(xiǎn)。
　　結(jié)論:對(duì)遺傳性難治性溶血性貧血患兒基因檢測(cè)結(jié)果顯示，單基因位點(diǎn)及復(fù)合位點(diǎn)基因突變是兒童遺傳性難治性溶血性貧血的常見病因。同時(shí)，二代基因測(cè)序技術(shù)作為遺傳性難治性溶血性貧血的一種具有高效性且特異性高的檢查手