TEF-1δ表達(dá)改變作為新的鎘暴露特異標(biāo)志物的體內(nèi)研究.pdf

1、1.目的:鎘(Cadmium，Cd)及其化合物是一類工業(yè)毒物和環(huán)境污染物，并在職業(yè)和環(huán)境中長期存在。鎘又是一種生物半減期很長（19～30年）的多器官、多系統(tǒng)毒物，如腎損傷、肝損傷、呼吸系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)障礙、骨骼系統(tǒng)損害，甚至導(dǎo)致多種癌癥的發(fā)生等。根據(jù)國際癌癥研究組織(IARC)的報(bào)告，鎘及其相關(guān)化合物是確認(rèn)的第一類致癌物，是人類危害最大的金屬毒物之一。因此，鎘暴露及其健康損害，特別是鎘低水平長期毒作用已經(jīng)成為毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)，其中探討

2、鎘暴露特異標(biāo)志物和相關(guān)疾病，是預(yù)防和早期診治之根本。近年來，翻譯延伸因子1d（the mouse translation elongation factor-1d，TEF-1δ）被鑒定為一個(gè)新的鎘應(yīng)答原癌基因。但是，TEF-1δ基因是否可作為潛在的鎘暴露生物標(biāo)志物尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過創(chuàng)建大鼠慢性鎘暴露模型，對(duì)血中TEF-1δ的表達(dá)改變作為新的鎘暴露生物標(biāo)志物進(jìn)行研究。
　　 2.方法:
　　 2.1 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)找出Cd

3、Cl2染毒SD大鼠100％和0％死亡的劑量范圍，求出正式實(shí)驗(yàn)的劑量比，以此等比級(jí)差設(shè)6個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組8只大鼠，觀察大鼠CdCl2急性中毒情況，采用改良寇氏法測(cè)定CdCl2溶液腹腔注射對(duì)大鼠的LD50。
　　 2.2 用SPF級(jí)別SD大鼠96只按體重隨機(jī)分4組，3個(gè)CdCl2實(shí)驗(yàn)組（高劑量1.225mg/kg、中劑量0.612mg/kg和低劑量0.306mg/kg,）和1個(gè)生理鹽水對(duì)照組（0.9％ NaCl），每組

4、24只大鼠，雌雄各半，腹腔注射，每周染毒5次，連續(xù)14周。之后所有的大鼠均置于代謝籠中收集24小時(shí)尿液，然后剖殺收集血液和內(nèi)臟器官。
　　 2.3 內(nèi)臟器官包括肝、腎、心和肺，計(jì)算臟器系數(shù)并且做病理切片以觀察組織形態(tài)學(xué)變化。測(cè)定血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）作為肝功能生化指標(biāo)，測(cè)定血中尿素氮（BUN）、血肌酐（SCR）、尿肌酐（CR）以及24小時(shí)尿蛋白(24hPro)作為腎功能生化指標(biāo)。
　　 2.4

5、血液、尿液和器官組織用原子分光光度計(jì)測(cè)定其鎘的含量。血白細(xì)胞和器官組織分別提取總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）和熒光定量PCR(FQ-PCR)法分析其TEF-1δ因子的表達(dá)水平。最后，對(duì)血中TEF-1δ因子表達(dá)水平與血鎘、尿鎘、肝鎘、腎鎘、心鎘、肺鎘含量和肝腎功能變化以及各器官組織的TEF-1δ因子表達(dá)水平之間分別作相關(guān)性分析。
　　 3.結(jié)果:
　　 3.1 急性染毒試驗(yàn)的結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)大鼠絕對(duì)致死量為26.

6、00 mg/kg，最大耐受劑量為11.54 mg/kg，實(shí)驗(yàn)劑量組依次為26.00、22.10、18.79、15.97、13.57和11.54 mg/kg。鎘中毒大鼠一般在8小時(shí)內(nèi)死亡，少數(shù)在72小時(shí)內(nèi)死亡；CdCl2溶液腹腔注射對(duì)大鼠的LD50為18.37 mg/kg，95％的可信區(qū)間是16.56～20.38 mg/kg。
　　 3.2 大鼠經(jīng)過不同鎘濃度慢性染毒14周后，不同鎘暴露的大鼠血、尿和肝、腎、心及肺臟器中的鎘含量均

7、有不同程度升高，并隨著鎘的暴露水平的增加而升高，存在明顯的劑量依賴關(guān)系(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)組大鼠肝、腎、心、肺組織的臟器系數(shù)均有不同程度升高，并隨著鎘的暴露水平的增加而升高，具有明顯的劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組大鼠肝、腎、心、肺組織的的病理切片中與對(duì)照組相比較均觀察到病理學(xué)改變。鎘染毒的大鼠中肝功能生化指標(biāo)AST和ALT的活性相對(duì)于對(duì)照組均有升高，并隨著鎘的暴露水平的增加而升高，具有劑量-反應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。腎功能生化

8、指標(biāo)Scr、BUN和24小時(shí)尿蛋白(24hPro)的活性相對(duì)于對(duì)照組均有升高，并隨著鎘的暴露水平的增加而升高，具有劑量-反應(yīng)關(guān)系(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)顯示CdCl2染毒劑量已經(jīng)引起肝、腎、心、肺組織的不同程度的損害。
　　 3.3 經(jīng)RT-PCR分析，血和肝、腎、心、肺中的TEF-1δ因子表達(dá)量以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化計(jì)算，初步顯示CdCl2染毒的大鼠血、肝、腎、心和肺組織中TEF-1δ的mRNA表達(dá)水平均有不同程度

9、升高，并隨著鎘的暴露水平的增加而升高，具有明顯的劑量依賴關(guān)系(P<0.05)。FQ-PCR定量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，TEF-1δ表達(dá)量以hACTIN為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化計(jì)算，低、中、高劑量組的TEF-1δ相對(duì)拷貝數(shù)分別與對(duì)照組相比，血細(xì)胞分別是2.54倍、4.28倍和23.54倍，肝組織分別是3.59倍、12.53倍和75.00倍，腎組織分別是16.10倍、53.59倍和159.14倍，心組織分別是3.14倍、5.33倍和13.17倍，肺組織

10、分別是2.37倍、3.92倍和8.02倍，顯示大鼠血、肝、腎、心和肺組織中TEF-1δ的mRNA表達(dá)水平均有不同程度升高，并隨著鎘的暴露水平的增加而升高，具有明顯的劑量依賴關(guān)系(P<0.01或P<0.05)。
　　 3.4 經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)大鼠血中的TEF-1δ的mRNA表達(dá)水平與鎘在大鼠血、尿、肝、腎、心、肺中的蓄積濃度有正相關(guān)關(guān)系；與內(nèi)臟器官肝、腎、心和肺中TEF-1δ表達(dá)水平存在明顯正相關(guān)；大鼠血和內(nèi)臟器官中的

11、mRNA表達(dá)還與肝功能生化指標(biāo)（AST,ALT）和腎功能生化指標(biāo)（24hpro,BUN，Scr）異常存在正相關(guān)關(guān)系，并與肝、腎、心、肺組織的病理學(xué)改變相關(guān)。結(jié)果表明，血中TEF-1δ因子表達(dá)水平與大鼠的血、肝、腎、心、肺組織的鎘暴露水平及其引起的內(nèi)臟器官異常效應(yīng)和臟器TEF-1δ因子表達(dá)水平呈現(xiàn)出良好的劑量依賴關(guān)系及劑量-反應(yīng)關(guān)系(P<0.01或P<0.05)。
　　 4.結(jié)論:
　　 4.1 創(chuàng)建了大鼠慢性鎘暴露模型，

12、發(fā)現(xiàn)鎘可以在大鼠血液、尿液、肝、腎、心和肺組織中蓄積，蓄積量表現(xiàn)為：血液>尿液,腎>肝>心>肺；鎘可以引起肝、腎、心和肺臟器系數(shù)的增大和不同程度的病理改變，同時(shí)引起肝和腎功能生化指標(biāo)改變，反映鎘可致肝、腎、心和肺的慢性損害，具有明顯的劑量-反應(yīng)關(guān)系，為鎘化物的劑量長期毒性補(bǔ)充了新的科學(xué)數(shù)據(jù)。
　　 4.2 在慢性鎘中毒模型中觀察到鎘對(duì)大鼠血及內(nèi)臟器官翻譯延伸因子1d（TEF-1δ）基因表達(dá)的誘導(dǎo)作用，揭示血中TEF-1δ因子表達(dá)