苯并(a)芘暴露對(duì)羅非魚(yú)體內(nèi)主要生物標(biāo)志物影響的研究.pdf

1、苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene，BaP)是一種五環(huán)多環(huán)芳烴，是一類理化性質(zhì)穩(wěn)定、難以降解且具致癌致畸性質(zhì)的環(huán)境污染物，可隨著降雨、工業(yè)廢水排放、表面徑流等方式進(jìn)入水體。近年來(lái)，隨著我國(guó)工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，水體BaP的污染越來(lái)越嚴(yán)重，已經(jīng)引起人們的重視。
　　 苯并芘的生物監(jiān)測(cè)一直是環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的重要內(nèi)容。本試驗(yàn)以羅非魚(yú)為試驗(yàn)材料，研究不同濃度的苯并(a)芘暴露對(duì)羅非魚(yú)體內(nèi)生物標(biāo)志物-膽汁BaP代謝物、肝臟CYP

2、lA1及GST的活性、DNA損傷及肝臟卵黃蛋白原基因表達(dá)的影響，為分析和評(píng)價(jià)BaP的生態(tài)毒性和遺傳毒性提供科學(xué)依據(jù)，并為淡水環(huán)境中BaP的監(jiān)測(cè)提供可行的方法。
　　 在BaP暴露后的2h、6h、12h、48 h、4d、7d、14d采集羅非魚(yú)的膽汁，利用固定波長(zhǎng)熒光分光光度法(Fixed wavelength fluorescence，F(xiàn)F)測(cè)定膽汁中BaP代謝物。本試驗(yàn)首先建立針對(duì)羅非魚(yú)的FF法。將羅非魚(yú)膽汁分別稀釋1000倍、

3、2000倍、4000倍、8000倍，在激發(fā)/散發(fā)波長(zhǎng)380/430 nm測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示2000倍左右的稀釋較為合理，結(jié)合其他研究，本試驗(yàn)最終采用1600倍的稀釋倍數(shù)。BaP暴露試驗(yàn)的結(jié)果顯示0.1μg/L濃度組的BaP代謝物物隨時(shí)間變化無(wú)明顯波動(dòng)，與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05）;其他三個(gè)劑量組從2h起就與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05，P＜0.01)。三個(gè)試驗(yàn)組均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，50μg/L組在48 h后開(kāi)始下降，而1

4、μg/L、10μg/L組并未出現(xiàn)一個(gè)明顯的峰值，但也分別在7d和4d后下降。膽汁中BaP代謝物隨濃度升高不斷升高，呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 在BaP染毒后2h、6h、12h、48 h、4d、7d、14d采集魚(yú)的肝臟，測(cè)定肝臟CYPlA1、GST的活性。結(jié)果表明0.1μg/L、1μg/L、10μg/L三個(gè)劑量組的CYPlA1活性與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），50μg/L劑量組的CYPlA1活性在6h、7d被顯著誘導(dǎo)

5、(P＜0.01);0.1μg/L、1μg/L肝臟GST活性與對(duì)照組無(wú)差異(P＞0.05），10μg/L、50μg/LGST活性在14 d時(shí)與對(duì)照組差異顯著(P＜0.05）。研究CYPlA1活性與GST活性之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，兩者的變化趨勢(shì)相近，尤其是1μg/L、50μg/L兩個(gè)劑量組，表明這兩者之間可能存在一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系。利用單細(xì)胞凝膠電泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)檢測(cè)肝臟DNA損傷。于染毒

6、4d、7d、14d取羅非魚(yú)的肝臟，立即進(jìn)行彗星試驗(yàn)，以尾部DNA含量(TDNA％)、尾長(zhǎng)(TL)、尾矩(TM)、Olive尾矩(0TM)四個(gè)指標(biāo)對(duì)DNA損傷進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明BaP會(huì)對(duì)肝細(xì)胞DNA造成不同程度的損傷。在0.1μg/L、1μg/L、10μg/L三個(gè)濃度組，DNA損傷隨著B(niǎo)aP暴露濃度的增加而增加，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，50μg/L組DNA損傷有所下降。在時(shí)間上，除1μg/L劑量組的尾部DNA含量、10μg/L組的尾部DN

7、A含量及Olive尾矩外，其他指標(biāo)有在第7d降低之后又升高的趨勢(shì)，0.1μg/L劑量組尤為明顯，7d時(shí)的4個(gè)指標(biāo)顯著低于第4d和第14 d(P＜0.05)。
　　 卵黃蛋白原(Vitellogenin，Vtg)是檢測(cè)環(huán)境雌激素的重要生物標(biāo)志物。雄性魚(yú)類VtgmRNA是檢測(cè)環(huán)境雌激素的新興生物標(biāo)志物。為研究BaP是否具有環(huán)境雌激素效應(yīng)，本試驗(yàn)對(duì)羅非魚(yú)Vtg mRNA進(jìn)行了研究。用總RNA提取試劑盒取得雌魚(yú)肝臟總RNA，用Ester

8、huyse和自己設(shè)計(jì)的引物，以轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，分別得到422bp和687bp的羅非魚(yú)卵黃蛋白原特異性cDNA擴(kuò)增片段。采用熒光定量PCR法檢測(cè)10μg/、50μg/L的BaP暴露對(duì)羅非魚(yú)肝臟Vtg基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4d、17d時(shí)雄性羅非魚(yú)肝臟內(nèi)Vtgm RNA表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)差異(P＞0.05），10d時(shí)10μg/L、50μg/L兩個(gè)劑量組Vtg mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P＜0.01），分別是對(duì)照組的113.18倍