小鼠β防御素-6的克隆和鑒定、小鼠β防御素-4、6以及人β防御素-3在肺組織中的表達(dá)研究.pdf

1、目的:(1)從小鼠肺組織里克隆mBD-6的cDNA。(2)觀察肺組織中小鼠β-防御素-4、6的基因表達(dá)水平，探討mBD-4、6在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用。(3)研究小鼠β-防御素4、6在乳鼠和成年鼠肺部的表達(dá)和調(diào)控情況。(4)建立檢測(cè)hBD-3mRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，對(duì)肺癌患者的癌組織、正常肺組織進(jìn)行檢測(cè)，從mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析hBD-3基因在肺癌的表達(dá)，以便用于進(jìn)行其與肺癌的關(guān)聯(lián)性的探討。 方法:(1)提取

2、大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射后小鼠肺組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，采用PCR的方法克隆小鼠β防御素-6基因。PCR產(chǎn)物連接入pGEM-EAST載體，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白篩選，對(duì)PCR鑒定含有目的片段的克隆進(jìn)行測(cè)序。(2)將成年小鼠隨機(jī)分為兩組，一組為急性肺損傷組，一組為對(duì)照組。用大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射復(fù)制急性肺損傷模型，于不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，采用Trizol法提取肺組織總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量RCR檢測(cè)肺組織beta-防御

3、素-4、6基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平，測(cè)序鑒定PCR產(chǎn)物的特異性。(3)乳鼠與成年鼠各一組，用大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射兩組小鼠，于不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠，采用Trizol法提取肺組織總RNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肺組織beta-防御素-4、6基因在不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)水平。(4)應(yīng)用SYBRGreenI熒光定量技術(shù)，利用GAPDH作參照，建立檢測(cè)hBD-3mRNA的實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄FQ-PCR方法，并檢測(cè)13份正常肺組織和16份肺癌組織標(biāo)本h

4、BD-3mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果:(1)獲得預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，經(jīng)序列鑒定證實(shí)為小鼠β防御素-6基因。(2)病理結(jié)果證實(shí)ALI動(dòng)物模型復(fù)制成功。對(duì)照組肺組織中各時(shí)間點(diǎn)及ALI組6h點(diǎn)均無β-防御素-4、6基因表達(dá)。而ALI組12h、1d、3d時(shí)表達(dá)顯著升高。(3)小鼠β-防御素-4、6mRNA在LPS刺激12h后的幼鼠和成年鼠肺組織中均有表達(dá)，熒光定量證實(shí)乳鼠LPS刺激后不同時(shí)間點(diǎn)肺組織β-防御素-4、6mRNA的表達(dá)量低于

5、成年鼠，差異顯著(P＜0.01)。(4)hBD-3在肺癌和正常肺組織中的表達(dá)有明顯差別，說明肺癌組織中的hBD-3表達(dá)明顯高于正常肺組織，其表達(dá)量為正常肺組織的3.31倍。 結(jié)論:(1)獲得了小鼠β防御素-6基因，為進(jìn)一步構(gòu)建表達(dá)載體，表達(dá)小鼠β防御素-6蛋白，獲取其基因工程產(chǎn)品及臨床抗感染治療打下了基礎(chǔ)，同時(shí)也為深入探討小鼠β防御素-6的作用機(jī)制提供可能。(2)ALI上調(diào)肺組織中β-防御素-4、6基因的表達(dá)；β-防御素-4、6

6、基因的誘導(dǎo)性表達(dá)可能通過參與“細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)”和“細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)”與ALI的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。(3)本實(shí)驗(yàn)表明大腸桿菌內(nèi)毒素可以誘導(dǎo)β-防御素-4、6在乳鼠和成年鼠肺部表達(dá)，β防御素-4、6在乳鼠和成年鼠肺組織中表達(dá)差異顯著，說明此表達(dá)與小鼠年齡、發(fā)育有關(guān)。這些結(jié)果揭示當(dāng)乳鼠細(xì)胞免疫防御系統(tǒng)還不成熟時(shí)，乳鼠肺部的先天免疫屏障作用也低于成年鼠。提示乳鼠肺組織β-防御素-4、6的誘導(dǎo)表達(dá)量低下可能是乳鼠免疫反應(yīng)不成熟的部分表現(xiàn)。(4)建立的hBD-3m