人α-防御素3在光合細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides中的表達(dá)研究.pdf

1、Rhodobacter（Rb）. sphaeroides以及其它的光合細(xì)菌能以好氧、厭氧、發(fā)酵和厭氧光合作用等多種方式生長(zhǎng)。其中，在厭氧光合作用條件下，捕光色素復(fù)合蛋白體2(LH2)和捕光色素復(fù)合蛋白體1(LH1)吸收光能，然后傳遞到光化學(xué)反應(yīng)中心(RC)并發(fā)生電荷分離，最終將光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能。LH2、LH1和RC組成光合機(jī)構(gòu)，它們?cè)诠夂献饔眠^程中發(fā)揮著重要作用。目前，對(duì)光合機(jī)構(gòu)的基本結(jié)構(gòu)、功能以及遺傳學(xué)背景的研究已相對(duì)比較成熟。Rb.

2、 sphaeroides是研究細(xì)菌光合機(jī)構(gòu)和光合作用的模式生物，已成功以非融合蛋白的形式異源表達(dá)了不同來源的LH2從而證明了它們的功能(Fowler et al,1995)。LH2、LH1和RC都屬于膜蛋白，光合細(xì)菌內(nèi)膜系統(tǒng)能夠大量表達(dá)膜蛋白，但是，至今尚未有光合細(xì)菌捕光系統(tǒng)以外的蛋白質(zhì)在其中表達(dá)的報(bào)道。人α-防御素3(HNP-3)的氨基酸序列人工設(shè)計(jì)了四條引物 P1、P2、P3、P4，三輪 PCR擴(kuò)增出編碼 HNP-3的DNA片段并克

3、隆到pRKpucP*BHis10AC中構(gòu)建了pucB-HNP-3的融合蛋白表達(dá)載體pRKpucP*BHNP-3His10AC，最后借助E.coli S17-1通過接合轉(zhuǎn)移將其導(dǎo)入宿主Rb. sphaeroides DD13(基因組缺失pucBAC和pufBALMX)。誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白質(zhì)并提取純化，近紅外光譜分析和Western blot檢測(cè)驗(yàn)證了HNP-3能夠在Rb. sphaeroides DD13中表達(dá)。本研究取得的主要結(jié)果如下：<

4、br>　　①利用引物P1、P2、P3、P4，PCR擴(kuò)增出編碼HNP-3的DNA片段并克隆到pMD18-T中得到重組質(zhì)粒pMD18-T-HNP-3，并測(cè)序驗(yàn)證。
　　②利用Sac I和Xba I酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-HNP-3得編碼HNP-3的DNA片段，然后克隆到質(zhì)粒pRKpucP*BHis10AC中得pucB-HNP-3的融合蛋白表達(dá)載體pRKpucP*BHNP-3His10AC。
　　③利用E.coli S17-1

5、通過接合轉(zhuǎn)移將 pRKpucP*BHNP-3His10AC和對(duì)照pRKpucP*pucC、pRKpucP*BHis10AC導(dǎo)入宿主Rb. sphaeroides DD13得到菌株Rb. sphaeroides DD13/pRKpucP*BHNP-3His10AC、Rb. sphaeroides DD13/pRK pucP*pucC和Rb. sphaeroides DD13/pRKpucP*BHis10AC。
　　④近紅外光譜分析顯

6、示HNP-3能夠進(jìn)入Rb. sphaeroides DD13內(nèi)膜，融合蛋白pucB-HNP-3得到表達(dá)。
　?、?pRKpucP*BHNP-3His10AC中雜合啟動(dòng)子 pucP*的活性受到氧氣濃度和IPTG調(diào)控，半好氧培養(yǎng)并添加IPTG后，外源蛋白質(zhì)大量誘導(dǎo)表達(dá)。
　　⑥提取了目的蛋白pucB-HNP-3，Western blot檢測(cè)證實(shí)了HNP-3能夠在光合細(xì)菌 Rb. sphaeroides DD13中表達(dá)，達(dá)到了預(yù)期