番茄紅素的一種新型生產(chǎn)途徑——Erwinia herbicola的crtI基因在Rhodobacter sphaeroideS中表達(dá).pdf

1、番茄紅素是一種在動(dòng)植物體中廣泛分布的類(lèi)胡蘿卜素，呈紅色，因最先發(fā)現(xiàn)于番茄而得名，分子式為C40H56，分子量為536.88。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究和調(diào)查表明，番茄紅素具有優(yōu)越的生理功能，因而在食品、化妝品以及醫(yī)藥領(lǐng)域有重要的應(yīng)用。目前，番茄紅素的生產(chǎn)工藝已成為國(guó)內(nèi)外許多公司研究與開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)，特別是隨著不同生物類(lèi)胡蘿卜素合成基因的相繼克隆,為利用微生物發(fā)酵來(lái)獲取番茄紅素提供了可能。
　　crtI基因編碼八氫番茄紅素脫氫酶，在不同的物種其作

2、用有所不同。在Erwinia herbicola中，八氫番茄紅素經(jīng)過(guò)八氫番茄紅素脫氫酶的四步脫氫作用形成番茄紅素，而在光合細(xì)菌Rhodobacter sphaeroides中則經(jīng)過(guò)三步脫氫作用形成鏈孢紅素。本文介紹了，將E. herbicola中的crtI基因轉(zhuǎn)化到光合細(xì)菌R. sphaeroides中異源表達(dá)，使原來(lái)不生產(chǎn)番茄紅素的光合細(xì)菌R. sphaeroides經(jīng)過(guò)改造后生產(chǎn)番茄紅素。本研究取得的主要結(jié)果如下：
　　1.應(yīng)

3、用結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法成功的將含有外源基因crtI的表達(dá)載體pRKR5轉(zhuǎn)入光合細(xì)菌R. sphaeroides中構(gòu)建工程菌。通過(guò)比較GenBank中已登錄的E. herbicola家族crtI基因的氨基酸序列和核苷酸序列，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用PCR技術(shù)，從E. herbicola069菌株基因組DNA中克隆出crtI基因的DNA序列約629bp，測(cè)序后比較發(fā)現(xiàn)與E. herbicola pv. Milletiae(GenBank登錄

4、號(hào)：AB076662)同源性高達(dá)95.8％；再根據(jù)E. herbicola pv. Milletiae基因序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物，從而擴(kuò)增出crtI全長(zhǎng)基因，GenBank登錄號(hào)為DQ408590；然后將crtI基因連接到含強(qiáng)啟動(dòng)子Puc的表達(dá)載體pRKR5上構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pRKR5-crtI，通過(guò)接合轉(zhuǎn)移的方式將其導(dǎo)入光合細(xì)菌R. sphaeroides突變株TC72中構(gòu)建基因工程菌。
　　2.通過(guò)調(diào)控氧濃度成功的誘導(dǎo)工程菌累積紅色色素

5、。由于啟動(dòng)子Puc在厭氧條件下高效表達(dá)，在工程菌培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)氧濃度進(jìn)行調(diào)控誘導(dǎo)其生產(chǎn)紅色色素。
　　3.經(jīng)HPLC和吸收光譜分析得出工程菌中合成的色素為番茄紅素，并初步計(jì)算番茄紅素的含量。提取工程菌中的紅色色素，采用紫外分光光度計(jì)和HPLC掃峰鑒定為番茄紅素；工程菌的生物量（干重）為2.36gDCW/L，利用公式初步計(jì)算番茄紅素含量為1.52mg/gDCW，與其它生產(chǎn)番茄紅素的工程菌相比，如大腸桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母，番茄紅素產(chǎn)量有一