應(yīng)用組織工程技術(shù)和人自體細(xì)胞探索可注射性真皮充填物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景及目的 面部年輕化一直是美容外科探索的課題，除了拉皮手術(shù)外，很多真皮充填物已被開發(fā)，用于消除皺紋和皮膚凹陷。自1981年牛膠原蛋白作為第一個(gè)用于去皺的充填品獲FDA批準(zhǔn)，越來越多的更安全更有效的注射物被推出。 目前國內(nèi)外常用的注射充填物根據(jù)來源可分為有以下幾類。 自體的：自體脂肪，自體細(xì)胞，自體膠原等； 同種異體的：人尸體組織的膠原，人成纖維細(xì)胞培養(yǎng)生成的膠原； 異種來源：來自于牛、豬的膠

2、原，來自于公雞冠或細(xì)菌發(fā)酵的透明質(zhì)酸及其衍生物類產(chǎn)品； 人工合成：硅樹脂(silicone)類產(chǎn)品，聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethylmethacrylate，PMMA)，羥基磷灰石，聚乳酸類，聚丙烯酰胺類。 非永久性注射充填物主要包括透明質(zhì)酸及其衍生物類、膠原、聚乳酸類及自體細(xì)胞等；永久性注射充填物主要包括硅樹脂類產(chǎn)品、PMMA、羥基磷灰石及自體脂肪。 但是它們各有優(yōu)缺點(diǎn)，自體脂肪存活有限，吸收率高，且只能

3、適合富有脂肪的人；牛膠原易過敏，有效時(shí)間短；Artecoll可產(chǎn)生肉芽腫，且只能皮下深部注射；透明質(zhì)酸鈉則有效時(shí)間短；單純成纖維細(xì)胞注射，需多次注射，價(jià)格昂貴且效果不盡人意<'[2]>。 理想的注射充填材料應(yīng)當(dāng)安全，方便，無痛，不留下任何使用過的痕跡，能長期地存留，但又無任何并發(fā)癥，如果要取出，它又可以容易而安全的取出；理想的注射充填材料應(yīng)該生物相容性好，無免疫排斥反應(yīng)，無毒性，無致傳染病，致熱和致癌性遷移等；最好價(jià)格不昂貴，易

4、保存，易消毒。 近年來，組織工程發(fā)展很快，在皮膚、角膜、肝、胰、軟骨、骨、血管、尿道、神經(jīng)系統(tǒng)等領(lǐng)域均取得了巨大的成績。但應(yīng)用組織工程技術(shù)研究可注射性真皮充填物是一個(gè)新的發(fā)展方向。其中細(xì)胞支架材料可以選擇可降解生物材料氧化異丙烯Plurolic-F127和可降解的注射充填材料(透明質(zhì)酸鈉、膠原等)，種子細(xì)胞可以選擇人體容易獲得的細(xì)胞，如來自皮膚和脂肪的細(xì)胞。利用組織工程技術(shù)，從少量人體的富余組織中分離出自體細(xì)胞，體外培養(yǎng)大量擴(kuò)增

5、，獲得種子細(xì)胞，將種子細(xì)胞和可吸收的細(xì)胞支架混合，形成細(xì)胞一支架復(fù)合物，將此自體復(fù)合物回注入皺紋下的真皮層內(nèi)，細(xì)胞支架逐漸降解而被吸收，自體細(xì)胞成活形成新的結(jié)締組織，分泌大量新的細(xì)胞基質(zhì)成份，從而，修復(fù)原有的真皮斷裂，重建、修復(fù)皮膚結(jié)構(gòu)，達(dá)到消除皺紋的目的。 Pluronic-F127被廣泛用于藥物的緩釋載體，沒有細(xì)胞毒性，不會(huì)引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，常溫下固化，可以塑形，4℃下為液態(tài)，而在液態(tài)狀態(tài)下便于用注射器將細(xì)胞與載體的復(fù)合物

6、注入體內(nèi)，使用方便，是常用的組織工程支架材料。 目前可降解的注射充填材料主要有：牛、豬的膠原，非動(dòng)物源性的透明質(zhì)酸及其衍生物類產(chǎn)品，羥基磷灰石微球，聚丙烯N，N-二甲基二烯丙基銨鹽共聚物。其中非動(dòng)物源性的透明質(zhì)酸，因其無致敏性、容易獲得且本身就是細(xì)胞基質(zhì)成份，從而作為本研究的細(xì)胞支架材料。 皮膚是人體最大的器官，細(xì)胞資源豐富，是一個(gè)龐大的細(xì)胞庫。而且，皮膚位于體表，易于取材：通常，外科手術(shù)均需切開皮膚，因而在進(jìn)行組織器官

7、缺損修復(fù)手術(shù)的同時(shí)，可以切取少量皮膚組織，甚至可以利用手術(shù)切除的多余皮膚組織來獲得大量的皮膚來源細(xì)胞。從皮膚獲得種子細(xì)胞不僅安全、方便，而且還可充分利用手術(shù)廢棄組織，不浪費(fèi)寶貴的人體細(xì)胞資源。皮膚成纖維細(xì)胞作為種子細(xì)胞已經(jīng)得到了深入的研究，Eaglstein WH用小兒包皮的成纖維細(xì)胞構(gòu)建組織工程化真皮，并廣泛應(yīng)用于臨床，促進(jìn)創(chuàng)面愈合；陳兵L5J等應(yīng)用皮膚成纖維細(xì)胞構(gòu)建組織工程化肌腱。自體培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞(Isolagen)也在美國、歐

8、洲等地治療凹陷皺紋及痤瘡后瘢痕，這是單純細(xì)胞技術(shù)在注射除皺方面的應(yīng)用，已有1450人接受過治療。人成纖維細(xì)胞可以由皮膚中分離出來，再通過體外培養(yǎng)擴(kuò)增，收集后可以回注到自體凹陷皺紋處，用來消除皺紋，對(duì)細(xì)淺紋有效，未發(fā)現(xiàn)并發(fā)癥，但對(duì)稍深的皺紋則無效，可能與單純成纖維細(xì)胞注射，細(xì)胞成活少，且細(xì)胞不易固定等有關(guān)。 自2001年Zuk首次證實(shí)經(jīng)吸脂術(shù)獲得的脂肪組織中存在具有多向分化潛能的細(xì)胞群后，脂肪干細(xì)胞(Adipose derived

9、 stem cells，ADSCs)的概念得以明確，其后ADSCs逐漸被人們所認(rèn)知并迅速進(jìn)入組織工程種子細(xì)胞研究領(lǐng)域。與BMSCs相比，ADSCs在人體內(nèi)分布范圍更廣，可利用的細(xì)胞總量更多，而且所需的脂肪組織可經(jīng)整形外科吸脂術(shù)(美容手術(shù))獲得，該手術(shù)操作簡單，創(chuàng)傷小，還能對(duì)病人進(jìn)行體型重塑，因此，病人易于接受，無心理障礙。正是基于以上考慮，我們認(rèn)為在種子細(xì)胞來源的選擇上，ADSCs較BMSCs更具優(yōu)勢，脂肪組織作為種子細(xì)胞來源，具有更加

10、廣闊的應(yīng)用前景。 人們對(duì)ADSCs的認(rèn)識(shí)到目前只有幾年的時(shí)間。1994年，Kaplan等發(fā)現(xiàn)病人皮下脂肪組織中有異位成骨現(xiàn)象，提出脂肪前體細(xì)胞能向成骨細(xì)胞分化的推斷，但其未證實(shí)脂肪組織中間充質(zhì)干細(xì)胞的存在。直至2001年，Zuk等從脂肪抽吸物中成功分離培養(yǎng)出具有骨、軟骨、脂肪、肌肉等多向分化潛能的細(xì)胞，ADSCs才真正被人們所認(rèn)識(shí)。此后的許多研究也均證實(shí)了ADSCs的多向分化潛能，包括向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞甚至

11、神經(jīng)細(xì)胞的分化。對(duì)此種細(xì)胞獲得率的研究發(fā)現(xiàn)，平均350ml脂肪抽吸物可分離出1×10單個(gè)核細(xì)胞，數(shù)量非?？捎^，自體抽吸量可獲得充足細(xì)胞，用于組織工程的研究。 故本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用組織工程技術(shù)，選擇可降解生物材料氧化異丙烯Plurolic-F127和透明質(zhì)酸鈉為支架材料，以人成纖維細(xì)胞和ADSCs為種子細(xì)胞，形成細(xì)胞一支架復(fù)合物，注射到裸鼠皮下構(gòu)建軟組織，為臨床探討一種更安全有效的除皺方法提供參數(shù)。 結(jié)論: 應(yīng)用組織工程技

12、術(shù)，可降解生物材料氧化異丙烯30％Plurolic-F127為支架材料，人成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞，以25×10<'6>細(xì)胞/ml混合，裸鼠皮下不能構(gòu)建出有形的組織。但應(yīng)用透明質(zhì)酸鈉為支架材料，能構(gòu)建出組織工程化軟組織。應(yīng)用組織工程技術(shù)，透明質(zhì)酸鈉為支架材料，以人脂肪干細(xì)胞(ADSCs)或成纖維細(xì)胞為種子細(xì)胞，能構(gòu)建出相當(dāng)好的組織工程化軟組織，且脂肪干細(xì)胞(ADSCs)為種子細(xì)胞更有優(yōu)勢，這為臨床尋找一種安全有效的除皺新方法提供了新的研究方