兔真皮內(nèi)注射自體真皮填充物后真皮結(jié)構(gòu)改變的對比研究.pdf

1、青春期之后，或是中年之后，人體表面的組織、結(jié)構(gòu)發(fā)生老化、松弛及萎縮等改變，從而引起皺紋產(chǎn)生。在皮膚的老化過程中真皮細(xì)胞也漸呈扁平，真皮纖維母細(xì)胞合成膠原纖維的能力下降，膠原含量逐漸下降。真皮內(nèi)彈力纖維變性，失去彈性，真皮乳突層的彈力纖維網(wǎng)減少甚至消失。真皮膠原纖維合成減少和彈性纖維變性，是皮膚老化引起皺紋、松弛及下垂的主要原因。
　　 近年來，隨著整形美容外科的蓬勃發(fā)展，以及人們對美的標(biāo)準(zhǔn)及意識的提升，而注射美容具有其不可取代的

2、優(yōu)點(diǎn)，如創(chuàng)傷小、效果顯著、恢復(fù)快等，使得注射性填充材料在面部注射除皺方面的應(yīng)用及需求量大大增加。
　　 自1982年FDA批準(zhǔn)牛膠原蛋白可應(yīng)用于注射美容以來，真皮填充物的應(yīng)用越來越普遍，其種類也有所增加，總體可歸為三大類:生物來源的填充物，人工合成的填充物及有活力的細(xì)胞移植物(1)。其中應(yīng)用較多的包括牛和人的膠原蛋白，透明質(zhì)酸，PMMA等。盡管上述這些填充物能夠快速達(dá)到顯著的改善效果，但它們均有各自的缺點(diǎn)，譬如，維持時(shí)間有限、發(fā)

3、生病毒感染、引發(fā)免疫反應(yīng)等(2-4)。從更深的層面來講，它們僅僅是填充劑，只能暫時(shí)從外觀上達(dá)到改善的目的，并不能刺激皮膚合成膠原蛋白(5)，而膠原蛋白的流失正是皮膚松弛、衰老的根本原因(6)，即這些填充物并不能從根本上解決面部老化的問題，無法維持長期療效。
　　 眾所周知，真皮中的膠原蛋白由成纖維細(xì)胞合成并分泌，它是皮膚組織細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。隨著年齡的增長，皮膚中成纖維細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，膠原蛋白的總含量以每年1％的速度流失

4、(7、8)，致使皮膚變薄、喪失彈性，最終形成皺紋。因此，增加真皮內(nèi)成纖維細(xì)胞的數(shù)量，刺激成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白才能從根本上解決面部老化的問題。
　　 近年來，有活力的細(xì)胞移植物逐漸成為面部年輕化的關(guān)注焦點(diǎn)。自體細(xì)胞移植物在面部年輕化中的應(yīng)用，不僅避免了其他填充物的各種副作用，而且存活的細(xì)胞似乎能發(fā)揮其相應(yīng)作用，從根本上改善老化的皮膚。目前已知有望達(dá)到長久除皺效果的自體細(xì)胞有兩種:人自體真皮成纖維細(xì)胞(Dermal Fibrobl

5、ast，DF)和脂肪組織來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ASCs)。
　　 自1995年，體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞(Isolagen)就已被當(dāng)做一種有活性的，動(dòng)態(tài)的蛋白修復(fù)系統(tǒng)用來改善皮膚老化及皮下組織缺損(9)。Isolagen療法是取患者自體皮膚，體外培養(yǎng)真皮成纖維細(xì)胞，待達(dá)到一定細(xì)胞數(shù)量級(1×107個(gè))后，配制成細(xì)胞懸液，即自體細(xì)胞移植物，注射填充面頸部皺紋，鼻唇溝或小面積凹陷性疤痕。此后各

6、國學(xué)者對細(xì)胞的存活，注射后副作用，效果維持時(shí)間作了各項(xiàng)相關(guān)性研究，并取得一定進(jìn)展。各項(xiàng)臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，自體成纖維注射可達(dá)到理想的除皺效果，且維持時(shí)間相對持久(9-14)，而受區(qū)未產(chǎn)生炎癥反應(yīng)或免疫排斥，研究表明亦無成瘤風(fēng)險(xiǎn)性(10)。這可能是自體成纖維細(xì)胞存活后，能夠產(chǎn)生大量正常的膠原蛋白，減慢自體皮膚膠原蛋白的流失速度，以達(dá)到除皺的效果。
　　 脂肪組織來源豐富，提取方便，實(shí)用性強(qiáng)，是近年來較受關(guān)注的自體細(xì)胞移植物的組

7、織來源(15)。皮下脂肪組織中的基質(zhì)血管片段內(nèi)所含有的間充質(zhì)干細(xì)胞，即脂肪組織來源干細(xì)胞(ASCs)，具有多向分化潛能（16-18），且ADSC能分泌多種細(xì)胞因子。各項(xiàng)臨床研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，自體ADSC可促進(jìn)骨創(chuàng)傷或缺損的修復(fù)(19-21)，促進(jìn)皮膚軟組織創(chuàng)傷的愈合(22-25)，在面部年輕化方面，有研究表明，ASCs及其培養(yǎng)基(ASCs-CM)有抗皺、美白皮膚、抗氧化的作用(26-29)。另外還有研究表明，自體脂肪移植后受區(qū)的膚質(zhì)較

8、前明顯有所改善(30)。盡管ASCs仍未像Isolagen那樣被直接當(dāng)作真皮填充物應(yīng)用于臨床除皺，但其有望應(yīng)用于面部皮膚年輕化的治療(26)。
　　 近年來，富含血小板的血漿(PRP)因其濃縮了患者自體的生長因子，也成為自體真皮填充物的一員。PRP是提取患者全血，抗凝后通過兩步離心法，最終提取出全血中大部分的血小板。皮內(nèi)注射PRP后，血小板被激活并釋放出大量的生長因子，刺激真皮內(nèi)成纖維細(xì)胞的增殖及膠原蛋白的分泌來達(dá)到除皺的效果。

9、目前PRP已經(jīng)被用來面部除皺或填充鼻唇溝。
　　 作為自體真皮填充物，DF，ASCs，PRP在面部微創(chuàng)美容中的應(yīng)用越來越為廣泛，究竟上述哪種自體填充物注射后對真皮結(jié)構(gòu)的影響最大，填充效果最好，本實(shí)驗(yàn)以兔為模型對其進(jìn)行了初步對比研究。
　　 材料與方法：
　　 1、實(shí)驗(yàn)試劑及器材
　　 DMEM/F12(1:1)、FBS、PBS液、胰蛋白酶均購自Hyclone公司;伊紅、美藍(lán)染液，天狼星紅-苦味酸染液，油紅

10、O染液，茜素紅染液，阿爾辛藍(lán)染液，DiI染液，二甲基亞砜溶液，Ⅰ型膠原蛋白酶購自Sigma公司;兔Ⅰ型膠原蛋白抗體購自Abcam公司;檸檬酸鈉溶液購自上海佳和生物科技有限公司;離心管、培養(yǎng)皿、吸管、過濾器等均購自Coming公司;蓋玻片，載玻片，組織剪，組織鑷，注射器，濾網(wǎng)，熒光顯微鏡，偏振光顯微鏡離心機(jī)，Sysmexkx-21血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀等。
　　 2、成纖維細(xì)胞，脂肪組織來源干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
　　 本實(shí)驗(yàn)中的8只新

11、西蘭大白兔均來自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。兔麻醉后取其腹股溝處皮膚及脂肪組織，分離并培養(yǎng)自體真皮成纖維細(xì)胞，ASCs，待細(xì)胞量達(dá)到1×107個(gè)時(shí)配制成細(xì)胞懸液行兔自體皮內(nèi)注射。
　　 3、PRP的提取
　　 從兔耳緣靜脈抽取全血約5ml，用濃度為3.8％的檸檬酸鈉0.5ml抗凝，400×g離心力離心10min，全血即分為3層:最上層為PPP，中間層為“buffycoat”，下層為紅細(xì)胞。將PPP及buffy-coat層用

12、吸管小心吸出，移入另一離心管，將吸出的PPP及buffy-coat混合物800×g離心力再次離心10min，可見血小板沉積于底層，將上層多余的PPP丟棄，剩余的血清和血小板混合均勻即為PRP，約0.5ml。
　　 4、細(xì)胞的標(biāo)記和鑒定
　　 本實(shí)驗(yàn)制備了兔真皮成纖維細(xì)胞(DermalFibroblast，DF)的細(xì)胞爬片，用免疫酶標(biāo)染色技術(shù)鑒別從真皮成纖維細(xì)胞并檢測爬片上細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原蛋白的合成。用油紅O對ASCs行成脂

13、染色，用茜素紅行成骨染色，用阿爾辛藍(lán)行成軟骨染色。用DiI染液分別標(biāo)記體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞和ASCs。
　　 5、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)
　　 將體外培養(yǎng)的細(xì)胞分別配制成濃度為1×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，與等體積的PRP分別吸入1ml注射器備用。0.5ml的PBS為對照組。將其中六只新西蘭大白兔背部剃毛，每只兔每種細(xì)胞均注射2個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)注射0.1ml;同樣，PRP及PBS如上述每只兔注射2個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)注射0.1ml。注射層次為真皮深

14、層，可見有明顯的皮膚隆起，注射點(diǎn)用甲紫作標(biāo)記。兩周時(shí)，每點(diǎn)均重復(fù)注射一次。
　　 另外兩只兔背部均注射DiI標(biāo)記后的DF和ASCs，細(xì)胞濃度與注射量與上述實(shí)驗(yàn)組均相同，兩周時(shí)，每點(diǎn)均重復(fù)注射一次。
　　 6、組織學(xué)檢測
　　 各個(gè)注射點(diǎn)均于四周后取材，將樣本分為四組:DF組（成纖維細(xì)胞注射組）、ASCs組（脂肪組織來源干細(xì)胞注射組）、PRP組（富含血小板血漿注射組）、PBS組（PBS注射組）。每個(gè)組織塊切片均行伊

15、紅-美藍(lán)、天狼星紅-苦味酸、免疫組織化學(xué)染色。觀察并比較皮膚樣本的厚度、各樣本皮膚中Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的比例、膠原蛋白的表達(dá)量。同時(shí)取各組皮膚樣本提?、裥湍z原蛋白，使用蛋白印跡法(westernblot)來檢測各組樣本中Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)有無差異。DiI標(biāo)記的細(xì)胞注射點(diǎn)四周后取材，組織塊行快速冰凍切片，然后熒光顯微鏡下觀察有無熒光反應(yīng)，間接反應(yīng)細(xì)胞的存活情況。
　　 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS1

16、3.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兔真皮厚度檢測結(jié)果及天狼星紅染色分析結(jié)果均使用ONEWAY-ANNOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、體外培養(yǎng)的P3代兔真皮成纖維細(xì)胞仍能合成Ⅰ型膠原蛋白，體外培養(yǎng)的ASCs有向脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞分化的能力，可用于注射。
　　 2、將DiI標(biāo)記的成纖維細(xì)胞及ASCs分別注射到兩只兔子的背部真皮內(nèi)，四周后取材，熒光顯微鏡下可見組織中仍有大片

17、散在的紅色熒光，證明細(xì)胞注射到真皮層中可以存活。
　　 3、可見各組皮膚組織的膠原纖維排列與對照組相比稍顯紊亂。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)DF組真皮層中藍(lán)染的梭型細(xì)胞核數(shù)量明顯多于其他各組。DF組的皮膚厚度最大，ASCs組次之，P＜0.05，PRP及PBS組皮膚厚度無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。
　　 4、各組皮膚組織中的Ⅰ型膠原蛋白含量并無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05，但DF組和ASCs組真皮中的Ⅲ型膠原蛋白含量較其他兩組高，P＜