維甲酸通路對脂多糖作用后的A549細(xì)胞SP-B表達(dá)的影響.pdf

1、呼吸窘迫綜合征（respiratory distress syndrome，RDS）是引起新生兒及成年人呼吸功能衰竭的常見臨床急重癥，以肺內(nèi)形成透明膜為其主要病變特征。一般認(rèn)為，新生兒呼吸窘迫綜合征的發(fā)生機制與肺表面活性物質(zhì)（pulmonary surfactant，PS），尤其是表面活性蛋白B（surfactant protein B，SP-B）的產(chǎn)生和釋放不足有關(guān)。足月新生兒及成人RDS的發(fā)生，其機制十分復(fù)雜，至今尚未闡明?；蛲蛔?/p>

2、、嚴(yán)重感染、缺氧等因素都可能引起。SP-B由肺泡II型細(xì)胞分泌至肺泡腔，是肺表面活性物質(zhì)的重要組成部分，對于PS的功能、組成和代謝方面有著重要作用。近年來研究表明，SP-B基因轉(zhuǎn)錄可以受維甲酸（retiretinoic acid，RA）信號通路的調(diào)節(jié)。RA屬于維生素A類化合物，在脊椎動物發(fā)育、細(xì)胞分化和維持體內(nèi)平衡中發(fā)揮廣泛的生物效應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，RA在促進(jìn)肺的發(fā)育、調(diào)控SP-B基因表達(dá)方面有著重要作用。研究表明，RA可增強人肺腺癌

3、細(xì)胞（H411）和培養(yǎng)胎兒肺組織中SP-B啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，增加SP-B mRNA、SP-B前蛋白含量。 感染是引起肺損傷和呼吸功能障礙的常見原因，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，可刺激組織細(xì)胞并導(dǎo)致多種炎性物質(zhì)（包括細(xì)胞因子）釋放、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。臨床資料表明嚴(yán)重感染與新生兒及成人呼吸窘迫綜合征均有密切關(guān)系，弄清其確切的發(fā)病機制對于我們選用合適的藥物進(jìn)行針對性治療十分重要。我們前期

4、的研究已證實 LPS 對人肺腺癌細(xì)胞A549 SP-B的表達(dá)具有抑制作用，但LPS對SP-B表達(dá)的影響是否與RA信號通路有關(guān)，以及RA能否預(yù)防或治療經(jīng) LPS 引起的SP-B的基因下調(diào)，國內(nèi)外尚未見明確報道。我們推測LPS引起的A549細(xì)胞SP-B表達(dá)下調(diào)可能有RA信號通路機制參與。 目的： 1.通過檢測維甲酸受體α（retinoic acid receptor α，RARα）在經(jīng)LPS處理后的A549細(xì)胞中的表達(dá)與分布

5、變化，以明確感染相關(guān)的肺透明膜病發(fā)病中有RAR異常的機制參與； 2.LPS處理前后給予全反式維甲酸（All-trans retinoic acid，ATRA），再觀察SP-B、RARα在A549細(xì)胞中的表達(dá)與分布改變，以探討RA對LPS引起的A549細(xì)胞SP-B表達(dá)下調(diào)是否有干預(yù)作用，為臨床預(yù)防和治療感染相關(guān)的肺透明膜病提供新的思路和實驗依據(jù)。 方法： 培養(yǎng)的人肺腺癌細(xì)胞A549，分為對照組和實驗組：以培養(yǎng)基培養(yǎng)

6、作為對照組；實驗組分為：LPS組，以終濃度為10μg/ml的LPS作用于培養(yǎng)的A549細(xì)胞24h；LPS+ATRA組，先以終濃度為10μg/ml的LPS作用于培養(yǎng)的A549細(xì)胞24h，再用1×10-6mol/ml的ATRA作用24h；ATRA+LPS組，在培養(yǎng)基內(nèi)先加入1×10-6mol/ml的ATRA作用于A549細(xì)胞24h，再加入終濃度為10μg/ml的LPS作用24h。倒置顯微鏡下觀察對照組及實驗各組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變；應(yīng)用免疫細(xì)胞

7、化學(xué)方法（SP法）檢測各組A549細(xì)胞中SP-B、RARα的表達(dá)及分布情況。 結(jié)果： 1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)表現(xiàn)：對照組A549細(xì)胞貼壁性生長，融合成片，多角形，細(xì)胞突起明顯，胞質(zhì)豐富，無核固縮；LPS組A549細(xì)胞胞體變圓，體積縮小，突起減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等的顆粒；LPS+ATRA組，較LPS組胞質(zhì)透亮，其內(nèi)顆粒少見；ATRA+LPS組，細(xì)胞形態(tài)與LPS組無明顯改變。 2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果： ① 實驗各

8、組SP-B表達(dá)：對照組，SP-B彌漫表達(dá)于A549細(xì)胞的胞質(zhì)中；LPS組A549細(xì)胞胞質(zhì)中SP-B表達(dá)較對照組明顯減弱，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；LPS+ATRA組A549細(xì)胞胞質(zhì)中SP-B表達(dá)較明顯，與對照組表達(dá)強度相近，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但較LPS組表達(dá)增強，且兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ATRA+LPS組A549細(xì)胞胞質(zhì)中SP-B表達(dá)較對照組明顯減弱，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，

9、但較LPS組表達(dá)無變化，且兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 ② 實驗各組RARα（胞核）的表達(dá)：對照組，RARα表達(dá)于A549細(xì)胞的胞核中；LPS組A549細(xì)胞胞核內(nèi)RARα表達(dá)減弱，與對照組比較，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；LPS+ATRA組，A549細(xì)胞胞核中RARα表達(dá)強度較對照組無明顯變化，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），但較LPS組表達(dá)增強，且兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ATRA+LPS

10、組，A549細(xì)胞胞核中RARα的表達(dá)較對照組明顯減弱，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但較LPS組無明顯變化，且兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 ③ 實驗各組RARα（胞質(zhì)）的表達(dá)：對照組，A549細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)RARα幾乎無表達(dá)；LPS組A549細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)RARα表達(dá)增強，與對照組比較，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；LPS+ATRA組，A549細(xì)胞胞質(zhì)中RARα表達(dá)強度較對照組無明顯變化，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

11、P>0.05），但較LPS組表達(dá)減弱，且兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；ATRA+LPS組，A549細(xì)胞胞質(zhì)中RARα的表達(dá)較對照組明顯增強，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但較LPS組無明顯變化，且兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論: 1.LPS可引起A549細(xì)胞SP-B蛋白水平下調(diào)，其機制可能與RARα表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)分布異常有關(guān)。 2.RA可能通過誘導(dǎo)RARα核內(nèi)表達(dá)而對LPS引起的A54