microRNA128-b對(duì)A549細(xì)胞EGFR表達(dá)調(diào)控的研究.pdf

1、目的和背景：肺癌（lungcancer）是最常見的惡性腫瘤之一，是人類因癌癥而死亡的首要原因。其中以非小細(xì)胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）最多見，約占肺癌發(fā)病總數(shù)的70-80％。對(duì)于早期NSCLC，目前首選的治療方法是手術(shù)治療，局部晚期NSCLC的主要治療手段為放療、化療、手術(shù)治療以及聯(lián)合這些手段的綜合治療。
　　 近年來，隨著對(duì)于腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究不斷深入，人們對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)

2、發(fā)及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)越來越深入，針對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路特異性分子靶點(diǎn)抗腫瘤治療新方法，具有針對(duì)腫瘤治療特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，效果顯著，是腫瘤治療中甚具前景的方法。在非小細(xì)胞肺癌中EGFR的研究最為深入。
　　 EGFR存在于所有正常上皮和部分間葉來源的細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化的調(diào)節(jié)具有重要作用。EGFR的胞內(nèi)區(qū)含有保守的酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。EGFR激活后可激活許多的下游信號(hào)途徑，主要有兩條：一條是ras-raf-MEK-erk/M

3、APK途徑，另一條是P13K-PKC-IKK途徑。研究顯示，EGFR功能異常包括蛋白突變、過表達(dá)、基因擴(kuò)增、誘導(dǎo)產(chǎn)生過量的配體形成自分泌或旁分泌等。這些變異導(dǎo)致受體在無需配體結(jié)合的情況下自體酪氨酸激酶持續(xù)活化，從而影響細(xì)胞的增殖、凋亡，細(xì)胞周期的調(diào)控等方面，因此針對(duì)EGFR酪氨酸激酶的抗腫瘤治療和EGFR的檢測(cè)成為近年來腫瘤研究的熱點(diǎn)。
　　 臨床上EGFR-TKI通過與ATP競(jìng)爭(zhēng)EGFR胞內(nèi)區(qū)激酶催化位點(diǎn)，阻斷EGFR激酶活性

4、。吉非替尼（Gefitinib，IressaTM）是一種特異性的EGFR酪氨酸激酶抑制劑，通過競(jìng)爭(zhēng)性地抑制ATP與受體胞內(nèi)區(qū)結(jié)合，從而抑制酪氨酸激酶活化，阻斷EGFR的傳導(dǎo)通路，達(dá)到抗腫瘤治療的目的。
　　 臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示吉非替尼的療效在不同的人群中差異較大，日本患者和歐洲患者中有效率分別為27.5％和10.4％。2004年，研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)EGFR基因18、19、21外顯子突變的NSCLC患者對(duì)吉非替尼的療效較好，而這種突變多見

5、于東亞人種、女性、非吸煙者、腺癌的患者。但在臨床中卻顯示部分EGFR基因野生型的患者同樣對(duì)吉非替尼治療療效較好，也有研究結(jié)果提示除了EGFR突變，EGFR-TKI治療的療效還與EGFR基因的拷貝數(shù)有關(guān)?？傊?，吉非替尼的療效仍偏低，應(yīng)用EGFR突變和EGFR基因的拷貝數(shù)對(duì)EGFR-TKI治療的療效和預(yù)后進(jìn)行預(yù)測(cè)仍有爭(zhēng)議。為突破這一研究瓶頸，有少數(shù)學(xué)者嘗試在分子水平找到靶向調(diào)控EGFR表達(dá)的新分子，使其成為EGFR靶向聯(lián)合治療的新靶點(diǎn)，以提

6、高腫瘤細(xì)胞對(duì)Gefitinib的敏感性。
　　 目前在這方面的研究已取得了一定的進(jìn)展，其中尤其以微RNA（microRNA，miRNA）的研究已成為目前肺癌領(lǐng)域的研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一?，F(xiàn)已證明，miRNA能抑制多種重要腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。如何找到能夠調(diào)節(jié)EGFR的miRNA成為當(dāng)前研究的一個(gè)重要突破口。為此G.J.Weiss等首先想到查找調(diào)節(jié)EGFR的miRNA，如果能夠上調(diào)EGFR的表達(dá)，可能會(huì)提高EGFR-TKIs的治療效果

7、。為此，他們查詢了TargetScan3.1數(shù)據(jù)庫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-128b在EGFR3UTR上有2個(gè)預(yù)測(cè)粘附點(diǎn)。隨后發(fā)現(xiàn)miRNA-128b位于染色體3P區(qū)，該區(qū)域等位基因缺失是肺癌發(fā)生過程中最頻繁和最早的遺傳學(xué)事件，在肺癌中等位基因缺失率為96％。檢測(cè)三個(gè)肺癌細(xì)胞系（H157，H3255和H520），發(fā)現(xiàn)其中兩個(gè)肺癌細(xì)胞系中miRNA-128b的拷貝數(shù)減少或缺失，其中在H3255細(xì)胞系中拷貝數(shù)減少或完全缺失，而在H520細(xì)胞系中

8、為高拷貝數(shù)。IHC染色法顯示：H3255中EGFR蛋白高表達(dá)，對(duì)吉非替尼敏感性較高，而H520中EGFR蛋白表達(dá)弱，對(duì)吉非替尼耐藥。提示miRNA-128b拷貝數(shù)與EGFR蛋白表達(dá)及吉非替尼敏感性呈負(fù)相關(guān)，miRNA-128b可能成為EGFR聯(lián)合治療的靶點(diǎn)。但對(duì)于其他肺癌細(xì)胞系研究的報(bào)道尚少，且由于miRNA對(duì)EGFR信號(hào)傳遞影響的機(jī)制比較復(fù)雜目前并未完全明了，因此，需要進(jìn)一步探討不同細(xì)胞系中miRNA-128b對(duì)EGFR表達(dá)調(diào)控及其與

9、Gefitinib敏感性的聯(lián)系。本課題選擇A549細(xì)胞，分別以microRNA128-b模擬劑和抑制劑處理，觀察其對(duì)EGFRmRNA和蛋白表達(dá)水平的影響及其對(duì)EGFR靶向藥物敏感性的影響。
　　 材料和方法：
　　 1、觀察miRNA-128b在正常人支氣管上皮HBE135-E6E7細(xì)胞系、人肺腺癌A549、H1650和HCC827細(xì)胞系的表達(dá)水平：采用Ambion公司的mirVanaTMmiRNAIsolationKi

10、t提取成熟miRNAs，經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定。采用Ambion公司的mirVanaTMqRT-PCRmiRNADetectionKit、mirVanaTMqRT-PCRPrimerSet、SuperTaqTMThermostableDNAPolymerase，采用U6-snRNA作為內(nèi)對(duì)照，進(jìn)行相對(duì)實(shí)時(shí)定量RT-PCR，測(cè)定HBE135-E6E7細(xì)胞、A549細(xì)胞和H1650細(xì)胞中miRNA-128b的表達(dá)水平。
　　

11、2、觀察miRNA-128b對(duì)A549細(xì)胞EGFRmRNA表達(dá)水平的影響：采用廣州銳博生物科技公司的特異性的miR-RiboTMmiRNA-128bmimics/inhibitor改變A549細(xì)胞內(nèi)miRNA-128b的活性，以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，采用相對(duì)實(shí)時(shí)定量RT-PCR法測(cè)定EGFRmRNA表達(dá)水平。
　　 3、觀察miRNA-128b對(duì)A549細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)水平的影響：采用廣州銳博生物科技公司的特異性的miR

12、-RiboTMmiRNA-128bmimics/inhibitor改變A549細(xì)胞內(nèi)miRNA-128b的活性，以組蛋白H3為內(nèi)參，采用Westemblot測(cè)定EGFR蛋白的表達(dá)水平。
　　 4、觀察miRNA-128b對(duì)A549細(xì)胞的EGFR-TKIs藥物敏感性的影響：采用廣州銳博生物科技公司的特異性的miR-RiboTMmiRNA-128bmimics/inhibitor改變A549細(xì)胞內(nèi)miRNA-128b的活性，通過MT

13、T法藥敏試驗(yàn)分別檢測(cè)處理前后的A549細(xì)胞株對(duì)EGFR靶向藥物--吉非替尼（易瑞沙，由英國(guó)阿斯利康提供）的藥物敏感性的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1、采用U6-sRNA作為內(nèi)對(duì)照，以HBE135-E6E7細(xì)胞的表達(dá)水平作為基準(zhǔn)，相對(duì)實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果表明A549、HCC827和H1650細(xì)胞系中miRNA-128b表達(dá)量均明顯下調(diào)，ANOVA分析差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　 2、采用Livak

14、Method，即2-△△Ct方法判定EGFRmRNA表達(dá)水平。以2-△△Ct大于2即相差倍數(shù)大于2，為表達(dá)量相差顯著。50nmol/L濃度的mimics處理的A549細(xì)胞中EGFRmRNA表達(dá)量是其對(duì)照組A549細(xì)胞中EGFRmRNA表達(dá)量的0.93倍，100nmol/L濃度的inhibitor處理的A549細(xì)胞中EGFRmRNA表達(dá)量是其對(duì)照組A549細(xì)胞中EGFRmRNA表達(dá)量的1.07倍，50nmol/L濃度的mimics和100

15、nmol/L濃度的inhibitor處理的A549細(xì)胞中EGFRmRNA表達(dá)量與對(duì)照組A549細(xì)胞中EGFRmRNA表達(dá)量相比無顯著差異。
　　 3、分別以50nmol/L濃度的miR-RiboTMmiRNA-128bmimics和以100nmol/L濃度的miR-RibonTMmiRNA-128binhibitor處理的A549細(xì)胞后，Westemblot結(jié)果顯示：mimics對(duì)照組蛋白含量值為9.51±0.29，mimics

16、組蛋白含量值為4.48±0.22，inhibitor對(duì)照組蛋白含量值為10.13±0.19，inhibitor組蛋白含量值為20.30±0.18。與對(duì)照組相比，mimics組的EGFR蛋白表達(dá)量顯著減少（P<0.05）；inhibitor組的EGFR蛋白表達(dá)量顯著增加（P<0.05）。
　　 4、用MTT法檢測(cè)不同濃度吉非替尼作用72h后細(xì)胞抑制率。吉非替尼對(duì)A549細(xì)胞有明顯的抑制作用，并且呈劑量依賴性。MTT法藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯

17、示：mimics對(duì)照組IC50值為5.51±0.12μmol/L，mimics組IC50值為11.5±0.08μmol/L，inhibitor對(duì)照組IC50值為5.86±0.10μmol/L，inhibitor組IC50值為2.63±0.11μmol/L。與對(duì)照組相比，mimics組的藥物敏感性顯著降低（P<0.05），inhibitor組的藥物敏感性顯著增加（P<0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1、同正常人支氣管上皮

18、HBE135-E6E7細(xì)胞系相比，人肺腺癌A549、H1650和HCC827細(xì)胞系中miRNA-128b的表達(dá)水平顯著降低。
　　 2、miRNA-128bmimics/inhibitor對(duì)EGFRmRNA的表達(dá)水平無顯著影響。
　　 3、miRNA-128bmimics顯著下調(diào)了EGFR蛋白的表達(dá)水平。miRNA-128binhibitor顯著上調(diào)了EGFR蛋白的表達(dá)水平。
　　 4、miRNA-128bmim