抑制KGFR表達(dá)對(duì)高氧暴露下A549細(xì)胞功能影響的研究.pdf

1、第一部分篩選KGFR沉默序列及對(duì)KGFR沉默A549細(xì)胞在高氧暴露下功能的初步研究
　　【目的】篩選有效的KGFR沉默序列,并研究高氧暴露下KGFR沉默的A549細(xì)胞的變化。
　　【方法】體外傳代培養(yǎng)A549細(xì)胞,轉(zhuǎn)染si-KGFR序列及si-NT序列,48h后收集細(xì)胞總RNA及總蛋白,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)KGFRmRNA的表達(dá);用Western blot法檢測(cè)KGFR蛋白表達(dá)的水平。對(duì)有效序列細(xì)胞通以950ml/L

2、高氧,對(duì)照組轉(zhuǎn)染置于同一室內(nèi)空氣中,觀察兩組細(xì)胞形態(tài)變化,用MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性的變化。
　　【結(jié)果】①序列特異性si-KGFR可抑制KGFR的表達(dá),si-KGFR-001、si-KGFR-002、si-KGFR-0033組KGFRmRNA表達(dá)均受到抑制,si-KGFR-002組抑制效率最高。
　?、谂c常氧對(duì)照組相比,si-KGFR-002轉(zhuǎn)染細(xì)胞對(duì)高氧的耐受性降低,細(xì)胞形態(tài)不良,細(xì)胞活力降低(p<0.005)。
　　

3、【結(jié)論】KGFR沉默下的A549細(xì)胞對(duì)高氧耐受性降低,表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)不良與細(xì)胞活性降低。
　　第二部分高氧暴露下抑制KGFR表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞的抗氧化功能的研究
　　【目的】研究抑制A549細(xì)胞KGFR表達(dá)后對(duì)高氧暴露A549細(xì)胞抗氧化性的影響,以及外源性給予α-硫辛酸(LA),角化上皮生長因子(KGF)后對(duì)細(xì)胞的影響。
　　【方法】體外傳代培養(yǎng)人肺腺癌A549細(xì)胞,隨機(jī)分為四組:
　?、駟渭兏哐踅M;
　　

4、Ⅱ高氧+si-KGFR組;
　　Ⅲ高氧+si-KGFR+LA組;
　?、舾哐?si-KGFR+KGF組。
　　各組通以950ml/L氧氣,分別于培養(yǎng)24h、48h、72h后收集細(xì)胞,Western blot法檢測(cè)各組KGFR蛋白表達(dá)的水平,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組A549細(xì)胞內(nèi)活性氧水平及細(xì)胞凋亡水平;WST法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)錳型超氧化物歧化酶活性。
　　【結(jié)果】與高氧對(duì)照組相比：
　　①KGFR沉默細(xì)胞胞內(nèi)ROS

5、水平較單純高氧細(xì)胞內(nèi)ROS水平高(p<0.005)。
　　②外源性LA、KGF可以減輕KGFR沉默細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(p<0.05)。
　　③高氧暴露所致的A549細(xì)胞死亡以早期凋亡為主,而高氧暴露對(duì)KGFR沉默細(xì)胞的致死效應(yīng)更為顯著(p<0.005)。
　　④外源性LA、KGF可以部分減輕高氧暴露對(duì)KGFR沉默細(xì)胞的致死效應(yīng)(p<0.005)。
　?、莞哐醣┞妒筀GFR沉默細(xì)胞錳型超氧化物歧化酶活性降低,但各組