pIRES-,2--AcGFP-,1--Nuc-TFPI真核雙表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定.pdf

1、人類組織因子途徑抑制因子（TFPI）是外源性凝血途徑的主要抑制因子，具有抑制FXa和FⅦa-TF復(fù)合物的功能，是機(jī)體主要的抗凝血因子之一。由于TFPI兼具抑制血栓形成、平滑肌細(xì)胞增殖和單核細(xì)胞趨化的三重功能，因此在血管再狹窄的防治中具有很好的應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建組織因子途徑抑制因子（TFPI）真核雙表達(dá)載體，以為TFPI基因治療用于防治血管再狹窄的研究提供有效手段。
　　 本實(shí)驗(yàn)以含有全長(zhǎng)cDNA的pIRES-TFPI為模板，P

2、CR擴(kuò)增TFPI全長(zhǎng)cDNA，經(jīng)酶切后插入到pIRES2-AcGFP1-Nuc載體中，構(gòu)建成雙順反子真核表達(dá)載體，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切圖譜分析、PCR擴(kuò)增及測(cè)序鑒定后命名為pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI。將其轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，分別采用熒光顯微鏡觀察、RT-PCR及ELISA的方法檢測(cè)GFP或TFPI在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。酶切圖譜分析、PCR擴(kuò)增及DNA測(cè)序證實(shí)雙順反子真核表達(dá)載體pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI構(gòu)建正確

3、；熒光顯微鏡檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)存在GFP蛋白的表達(dá)；RT-PCR證實(shí)經(jīng)TFPI基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞內(nèi)TFPI mRNA表達(dá)增高；ELISA檢測(cè)表明經(jīng)TFPI基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中存在TFPI蛋白，顯示TFPI蛋白能夠正常分泌到細(xì)胞外。
　　 本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建了包括人類組織因子途徑抑制因子和綠色熒光蛋白的真核雙表達(dá)載體，使得人類組織因子途徑抑制因子和綠色熒光蛋白的基因從同一個(gè)雙順反子mRNA互不干擾地同時(shí)表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了通過觀察綠