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文檔簡介
1、目的：構(gòu)建雙順反子真核表達載體PIRES2-EGFP-hBMP-2，檢測其表達。
方法：利用RT-PCR方法從人骨肉瘤組織中提取人骨形態(tài)發(fā)生蛋白hBMP-2基因，通過序列分析正確后，使之與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，選擇陽性克隆載體，進行擴增，提取質(zhì)粒。經(jīng)酶切回收后，與目的載體pIRES2-EGFP連接。用PCR技術(shù)及基因序列分析技術(shù)鑒定構(gòu)建結(jié)果。然后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染HEK293，通過熒光顯微鏡及We
2、sternblot技術(shù)觀測其表達。
結(jié)果：成功擴增了hBMP-2基因，基因片段長度為1102bp;pIRES2-EGFP-hBMP-2質(zhì)粒構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染HEK293細胞后可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光；提取的總蛋白行Westernblot檢測，可觀察到hBMP-2基因所表達蛋白的顯影條帶。
結(jié)論：重組HEK293細胞能成功表達EGFP及hBMP-2基因，并為pIRES2-EGFP-hBMP-2載體轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)
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