NHE1在人肝癌組織的表達(dá)及意義和pIRES2-AcGFP1-NHE1真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、NHE家族是存在于所有真核細(xì)胞細(xì)胞膜上的一種離子交換蛋白，介導(dǎo)細(xì)胞外的鈉離子和細(xì)胞內(nèi)的氫離子以1:1交換，其中NHE1亞型分布最為廣泛。NHE1蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值（pHi）、穩(wěn)定細(xì)胞容量、參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)、啟動(dòng)細(xì)胞增殖分化和凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞行為如侵襲和轉(zhuǎn)移等方面具有重要的作用。
　　最新提出的以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)pH值為目標(biāo)的基因治療中，NHE1受到格外重視。研究表明NHE1基因在許多腫瘤細(xì)胞，如肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胃癌等細(xì)胞中

2、有高表達(dá)，且其mRNA轉(zhuǎn)錄拷貝數(shù)比正常細(xì)胞增高約10倍，保證了Na+/H+泵數(shù)量與活性的升高。癌細(xì)胞具有無氧糖酵解優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)生大量的乳酸和H+，但癌細(xì)胞內(nèi)pH值偏堿性（pHi=7.12-7.65），組織間液的pH值（pHe）多為6.2-6.9。因此，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生與正常細(xì)胞相反的pH值梯度，并且這種梯度隨著腫瘤的發(fā)展而進(jìn)一步擴(kuò)大。癌細(xì)胞pH值內(nèi)高外低的形成和維持主要是由于細(xì)胞膜NHE1的激活和mRNA表達(dá)增加，從而使腫瘤細(xì)胞

3、進(jìn)行有效的Na+/H+交換，將大部分H+泵出細(xì)胞外，形成腫瘤細(xì)胞組織的酸性環(huán)境，保持細(xì)胞內(nèi)pH值為中性或堿性，從而使腫瘤細(xì)胞免受凋亡。本文就著眼于此，探索NHE1基因在人肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)，以及在細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲中的意義，并且通過構(gòu)建pIRES2-AcGFP1-NHE1質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究NHE1在肝癌中的調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)，期待為肝癌基因治療提供新靶點(diǎn)。
　　第一部分，
　　目的：探索人肝癌、癌旁組織中鈉氫交換蛋白NHE1mRNA

4、的表達(dá)變化及意義。
　　方法：連續(xù)收集自2007年12月到2008年04月，我科手術(shù)病理證實(shí)的、未行栓塞化療的34例肝細(xì)胞肝癌患者標(biāo)本，同時(shí)收集正常肝組織。取新鮮肝癌中最典型的癌灶部分、癌旁組織以及對(duì)照肝組織，將所有組織進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。
　　結(jié)果：所有肝癌組織和癌旁組織均表達(dá)NHE1，相對(duì)表達(dá)量分別為2.892±0.882和0.802±0.206；作為對(duì)照的21例正常肝組織NHE1的相對(duì)表達(dá)量為0.872±0.186。

5、肝癌組織和癌旁組織的NHE1mRNA相比，兩者存在顯著性差異(t=13.458，P<0.001)；肝癌組織和對(duì)照正常肝組織的NHE1mRNA相比，兩者亦存在顯著性差異(t=10.320，P<0.001)；癌旁組織和對(duì)照正常肝組織NHE1mRNA相比，兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.276，P>0.10)。將同一患者的肝癌組織和癌旁組織的NHE1mRNA相比，兩者存在顯著性差異(t=13.168，P<0.001)。
　　結(jié)論：NHE1

6、mRNA在肝癌組織的表達(dá)增高，可能在肝癌的發(fā)生機(jī)制中起一定的作用。
　　第二部分，
　　目的：肝癌組織中NHE1蛋白的表達(dá)以及與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。
　　方法：連續(xù)收集自2007年12月到2008年04月，我科手術(shù)病理證實(shí)的、未行栓塞化療的34例肝細(xì)胞肝癌患者標(biāo)本，同時(shí)收集正常肝組織。取新鮮肝癌中最典型的癌灶部分、癌旁組織以及對(duì)照肝組織，將所有組織進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)NHE1蛋白的表達(dá)水平，分析人HCC組織中NHE1

7、蛋白的表達(dá)情況與臨床病理因素之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：人HCC組織中NHE1蛋白的表達(dá)顯著高于癌旁組織中NHE1蛋白的表達(dá)（t=17.821，P<0.05），其陽性率也顯著高于癌旁組織（χ2=42.507，P<0.05）。NHE1蛋白的表達(dá)與組織學(xué)分級(jí)、臨床TNM分期以及有無門靜脈癌栓密切相關(guān)（P<0.05），而與HCC患者的年齡、腫瘤大小、腫瘤個(gè)數(shù)、血清AFP水平臨床病理學(xué)指標(biāo)無關(guān)（P>0.05）。
　　結(jié)論：NHE1蛋白

8、在人HCC組織中表達(dá)水平升高，可能與HCC的惡性程度、疾病的進(jìn)程以及人HCC的侵襲轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。
　　第三部分，
　　目的：構(gòu)建鈉氫交換蛋白1（NHE1）真核表達(dá)質(zhì)粒。
　　方法：利用RT-PCR方法擴(kuò)增帶有XholI和salI酶切位點(diǎn)的NHE1編碼基因，插入T載體測(cè)序正確后，克隆入pIRES2-AcGFP1真核表達(dá)載體，然后進(jìn)行酶切和測(cè)序鑒定。
　　結(jié)果：成功克隆了人NHE1基因，并進(jìn)行了DNA序列分析和基

9、因庫報(bào)道的基因序列基本一致，然后將克隆的NHE1基因插入克隆載體pIRES2-AcGFP1，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-AcGFP1-NHE1，并分別進(jìn)行了菌落分析和酶切鑒定。酶切及測(cè)序結(jié)果證明pIRES2-AcGFP1-NHE1表達(dá)質(zhì)粒的DNA序列完全正確。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建pIRES2-AcGFP1-NHE1真核表達(dá)質(zhì)粒，真核細(xì)胞中GFP的表達(dá)可作為NHE1表達(dá)的標(biāo)志，為進(jìn)一步研究NHE1在肝癌中的調(diào)控機(jī)制打下基礎(chǔ)。