NHE1和miR-29b在糖尿病內(nèi)皮功能異常中的作用及藥物干預(yù)研究.pdf

1、論文Ⅰ細(xì)胞內(nèi)pH值在糖尿病延緩心肌梗死后血管新生中的作用及干預(yù)
　　研究背景
　　與非糖尿病患者相比，糖尿病患者的心血管發(fā)病率和死亡率的風(fēng)險(xiǎn)顯著增高。糖尿病與血管閉塞后的不良預(yù)后相關(guān)，例如缺血性心臟病。血管生成對(duì)于心肌梗死（myocardial infarction，MI）之后重建對(duì)存活的心肌的血液供應(yīng)是至關(guān)重要的，并且因此在心臟功能的恢復(fù)中起到重要作用。血管生成依賴于內(nèi)皮的細(xì)胞增殖，遷移和小管生成。然而，糖尿病損傷血管生成

2、的分子機(jī)制仍然很大程度上未知。
　　所有真核生物細(xì)胞內(nèi)液的pH值被稱為細(xì)胞內(nèi)pH(intracellular pH，pHi)值。pHi值的輕微變化，即使在生理范圍內(nèi)，也可能改變細(xì)胞功能。在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中，pHi值由膜蛋白鈉氫交換蛋白1(Na+/H+ exchanger1，NHE1)嚴(yán)格控制。NHE1通過交換細(xì)胞內(nèi)H+和細(xì)胞外Na+以增加pHi值。在病理刺激下，NHE1被激活，在心臟重塑時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)堿化和細(xì)胞功能障礙。相比之下，我

3、們和其他學(xué)者研究表明，細(xì)胞內(nèi)酸中毒(intracellular acidosis，IA)通過抑制NHE1改善糖尿病時(shí)的內(nèi)皮功能，并抑制血管肥厚和心肌病變，表明NHE1激活在糖尿病血管并發(fā)癥的重要作用。然而，NHE1激活是否在糖尿病損傷血管生成中起重要作用尚未完全了解。
　　Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和血管生成中調(diào)節(jié)細(xì)胞存活，增殖和代謝等多種基本功能。許多與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子相關(guān)的血管生成功能是通過細(xì)胞內(nèi)活化的A

4、kt信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的。在內(nèi)皮細(xì)胞中，與NHE1活化相似，Akt的失活也參與糖尿病時(shí)的內(nèi)皮功能障礙。因此，我們假設(shè)Akt活性可能與pHi值相關(guān)，并且高血糖可能通過激活NHE1以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)堿化，引起Akt失活。本研究旨在研究NHE1抑制或Akt激活在高糖（High Glucose，HG）損害內(nèi)皮功能中的作用和機(jī)制，然后探索NHE1，Akt和NHE1選擇性抑制劑cariporide在糖尿病小鼠心肌梗死后的血管生成和心功能恢復(fù)中的作用。

5、>　　研究目的:
　　1.誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞內(nèi)酸化模型并研究Akt是否被IA激活
　　2.檢測(cè)HG對(duì)HUVECs中NHE1活性和pHi值的影響
　　3.研究抑制NHE1或過表達(dá)Akt能否逆轉(zhuǎn)HG損傷HUVECs的遷移能力和小管形成能力
　　4.研究NHE1和Akt對(duì)糖尿病小鼠MI后血管新生和心功能恢復(fù)的影響
　　5.研究NHE1抑制劑cariporide對(duì)糖尿病小鼠MI后血管新生和心功能的影響
　　

6、研究方法
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞內(nèi)酸化(IA)模型的建立
　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)進(jìn)行培養(yǎng)。IA模型用NH4Cl溶液負(fù)載法進(jìn)行誘導(dǎo)。首先，HUVECs用Tyrode緩沖液平衡90分鐘，然后用30mM NH4 Cl溶液培養(yǎng)5分鐘。最后用含NHE1抑制劑cariporide的Tyrode緩沖液或不含Na+的Tyrode緩沖液代替NH4Cl溶液從而誘導(dǎo)IA模型。
　　2.HUVECs細(xì)胞

7、轉(zhuǎn)染SiRNA
　　轉(zhuǎn)染NHESiRNA，研究NHE1對(duì)HUVECs小管形成和細(xì)胞遷移的影響。
　　3.HUVECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒
　　以攜帶Akt cDNA的慢病毒構(gòu)建lenti-Akt，慢病毒在含2％FCS的無抗生素培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染過夜。Lenti-Akt轉(zhuǎn)染的目的是研究其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞小管形成和細(xì)胞遷移的影響。
　　4.細(xì)胞內(nèi)pH值的測(cè)定
　　通過使用pH敏感性熒光染料BCECF在測(cè)量HUVECs中pHi值。

8、
　　5.細(xì)胞內(nèi)NHE1活性測(cè)定
　　在處理HUVEC后，通過使用測(cè)量NH4Cl負(fù)載法誘導(dǎo)的IA后pHi恢復(fù)的初始速率來測(cè)定NHE1活性。
　　6.體外小管形成實(shí)驗(yàn)
　　將HUVECs接種在用生長(zhǎng)因子減少的Matrigel膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿上，使用含或不含HG的培養(yǎng)基（含有0.5％FCS）培養(yǎng)。24小時(shí)后，通過顯微鏡拍攝照片。
　　7.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
　　應(yīng)用劃痕試驗(yàn)來檢測(cè)細(xì)胞的遷移。在將細(xì)胞接種到24

9、孔板中后，用滅菌的槍頭在板底部的劃十字。分別拍攝零點(diǎn)，一天，兩天，三天，四天時(shí)劃傷的交叉點(diǎn)，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)，并計(jì)算遷移率。
　　8.動(dòng)物模型的建立
　　將8-12周齡，20-25g的雄性野生型C57BL/6J小鼠飼養(yǎng)在溫度控制的籠中，并給予自由取水和正常食物。連續(xù)5天腹腔注射小劑量STZ(50 mg/kg/day)用于誘導(dǎo)胰島細(xì)胞破壞和持續(xù)性高血糖。當(dāng)STZ注射2周后隨機(jī)血糖水平大于300mg/dl時(shí)認(rèn)定為高血糖。
　

10、　通過結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)建立小鼠心肌梗死模型。首先，用2％異氟烷麻醉小鼠。然后，在小鼠胸骨左緣第4肋間開胸，并輕輕地將心臟從胸腔中擠出.用6.0號(hào)無損傷線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支(LAD)。
　　9.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心臟功能
　　MI手術(shù)后兩周，小鼠左側(cè)臥位進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的胸骨旁超聲。通過超聲心動(dòng)圖系統(tǒng)計(jì)算收縮或舒張的左心室內(nèi)徑（LVID或LVIDd），射血分?jǐn)?shù)(EF)和縮短分?jǐn)?shù)(FS)。
　　10.組織學(xué)染色

11、　　將心臟組織石蠟包埋，切片（5μm）染色。HE染色用于檢查梗死面積。免疫組織化學(xué)檢查α-SMA，NHE1，Akt，pAkt和endomucin。
　　11.蛋白印跡(Western blot)
　　從不同組的細(xì)胞和心臟組織提取蛋白質(zhì)。通過Westernblot檢測(cè)pAkt，Akt，NHE1，PTEN，pGSK的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果
　　1.IA增加內(nèi)皮細(xì)胞中的Akt磷酸化
　　在NH4Cl負(fù)載法誘導(dǎo)的

12、細(xì)胞內(nèi)酸化模型中，Akt的磷酸化水平和活性明顯增加。
　　2.HUVECs中的pHi值決定Akt磷酸化水平
　　將HUVECs細(xì)胞置于含nigericin的不同PH值的高K+-HBS緩沖液30min，此時(shí)pHi值等于細(xì)胞外pH(pHe)值。與7.2-7.4的pHi值相比，低pHi值(6.4-7.0)增加細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化。
　　3.PI3K參與內(nèi)皮細(xì)胞中IA誘導(dǎo)的Akt激活
　　PI3K抑制劑wortmanni

13、n在pHi值為6.4時(shí)顯著消除了細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化的升高，但在pHi值為7.4時(shí)不改變細(xì)胞中Akt磷酸化的水平，說明PI3K-PDK1信號(hào)傳導(dǎo)通路介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)酸化誘導(dǎo)的Akt磷酸化
　　4.HG刺激HUVECs可激活NHE1并抑制Akt磷酸化
　　HG刺激1小時(shí)后，NHE1活性明顯增加;而pHi值則在HG處理2小時(shí)后開始升高。但Akt磷酸化水平和活性在HG處理2小時(shí)后開始逐漸降低。
　　5.HG經(jīng)NHE1抑制Akt的磷酸

14、化
　　HG刺激后細(xì)胞經(jīng)NHE1抑制劑cariporide處理后，Akt的磷酸化水平和活性并沒有降低，表明HG誘導(dǎo)的Akt失活是通過活化NHE1實(shí)現(xiàn)的。
　　NHE1siRNA而非Control siRNA阻斷了高糖對(duì)Akt磷酸化的影響，進(jìn)一步說明NHE1的活化在HG抑制Akt磷酸化中有著不可或缺的作用。
　　6.HG通過NHE1激活和Akt抑制損傷HUVECs的小管形成能力
　　HG刺激后，與NHE1 siRN

15、A組相比，轉(zhuǎn)染Control siRNA的HUVECs小管形成明顯減少。Akt蛋白表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)HG干預(yù)后的小管形成。
　　7.HG通過活化NHE1和抑制Akt損傷HUVECs的遷移能力
　　HG可顯著抑制轉(zhuǎn)染Control siRNA或lenti-Vector慢病毒的HUVECs的遷移率，但對(duì)轉(zhuǎn)染NHE1 siRNA或轉(zhuǎn)染lenti-Akt慢病毒的HUVECs的遷移率無明顯影響。
　　8.高血糖通過激活NHE1或抑制

16、Akt減少小鼠MI后的血管生成
　　α-SMA和endomucin的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，NHE1缺失或Akt過表達(dá)的糖尿病小鼠梗死后心臟的毛細(xì)血管密度顯著增加。
　　9.NHE1缺失或Akt過表達(dá)促進(jìn)糖尿病小鼠MI后心臟功能的恢復(fù)
　　超聲結(jié)果顯示，NHE1缺失或Akt過表達(dá)改善糖尿病小鼠梗死后心臟功能。
　　10.Cariporide促進(jìn)糖尿病小鼠MI后的血管生成并改善心臟功能
　　α-SMA和endo

17、mucin免疫組織化學(xué)的結(jié)果顯示，Cariporide增加了糖尿病小鼠缺血心臟中的毛細(xì)血管和小動(dòng)脈密度，并且穩(wěn)定地降低心肌梗死后糖尿病小鼠的LVIDs和LVIDd，升高FS和EF。
　　研究結(jié)論
　　1.IA增加內(nèi)皮細(xì)胞中的Akt磷酸化;
　　2.HG通過NHE1激活和Akt抑制損傷HUVECs的小管形成和遷移能力;
　　3.NHE1缺失或Akt過表達(dá)促進(jìn)糖尿病小鼠MI后血管生成和心臟功能的恢復(fù);
　　4.

18、NHE1選擇性抑制劑Cariporide可促進(jìn)糖尿病小鼠MI后的血管生成并改善心臟功能。
　　關(guān)鍵詞:鈉氫交換蛋白1;Akt;血管生成;糖尿病;心肌梗死;pH值
　　論文ⅡmiR-29b在洛伐他汀保護(hù)糖尿病內(nèi)皮功能紊亂中的作用
　　研究背景
　　洛伐他汀可通過抑制HMG-CoA還原酶活性從而抑制HMG-CoA轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸，因此被用來治療高膽固醇血癥。從膽固醇代謝過程來看，越來越多的證據(jù)表明，他汀類藥物對(duì)心血管疾

19、病(cardiovascular diseases，CVD)有潛在的益處。已有研究證明氧化應(yīng)激可引起內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，而后者是包括動(dòng)脈粥樣硬化和高血壓在內(nèi)的心血管疾病的早期事件和標(biāo)志。他汀類藥物通過抑制血管細(xì)胞氧化應(yīng)激而阻止內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的作用這一觀點(diǎn)已被廣泛接受。然而，他汀抑制CVD中氧化應(yīng)激的作用靶點(diǎn)尚未完全闡明。
　　一些先前的研究已證明CVD發(fā)生過程中，蛋白酶體激活與氧化應(yīng)激以及隨后發(fā)生的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂相關(guān)。在真核細(xì)胞

20、中，蛋白酶體負(fù)責(zé)大多數(shù)目標(biāo)蛋白的降解。蛋白酶體的功能受激動(dòng)劑調(diào)節(jié)，激動(dòng)劑以單鏈或雙鏈的形式與20S核心催化亞基末端結(jié)合，并打開核心蛋白酶體的末端以使目標(biāo)蛋白進(jìn)入。作為蛋白酶體激動(dòng)劑家族(proteasome activators，PAs)的一員，PA200在哺乳動(dòng)物組織中廣泛表達(dá)，并在DNA損傷過程中起重要作用。
　　MicroRNA(miRs)是一種長(zhǎng)約20個(gè)核苷酸的單鏈小分子RNA，通過與目標(biāo)mRNA部分互補(bǔ)，抑制mRNA的降

21、解或翻譯來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。近日，Anna S等學(xué)者報(bào)告，microRNA在蛋白酶體活性的調(diào)節(jié)過程中起重要作用。進(jìn)一步研究表明，在骨髓瘤細(xì)胞中，miR-29b可通過作用于編碼PA200蛋白的PSME4基因抑制蛋白酶體。現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，在成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中，他汀類藥物如洛伐他汀可通過抑制蛋白酶體活性來發(fā)揮其作用。因此，確定他汀類藥物在CVD中是否通過上調(diào)miR-29b抑制蛋白酶體活性是十分有意義的。
　　在本實(shí)驗(yàn)中，我們

22、研究洛伐他汀如何調(diào)節(jié)PA200，并確定miR-29b在蛋白酶體激活中的作用。我們建立大鼠糖尿病和血脂異常模型，研究洛伐他汀和miR-29b在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙中的作用機(jī)制。
　　研究目的
　　1.研究洛伐他汀對(duì)miR-29b表達(dá)的影響;
　　2.研究洛伐他汀對(duì)蛋白酶體活性的影響及其機(jī)制;
　　3.研究大鼠糖尿病和高血脂模型中，洛伐他汀和miR-29b在氧化應(yīng)激介導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙中的作用機(jī)制。
　　研

23、究方法
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)進(jìn)行培養(yǎng)。
　　2.慢病毒載體的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染
　　包含scr-miR，anti-miR29b，pre-miR29b和PA200 cDNA的慢病毒由上海吉瑪公司構(gòu)建。慢病毒在含有2％FBS的無抗生素培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染過夜。然后洗滌細(xì)胞并在新鮮培養(yǎng)基中再溫育12小時(shí)后，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　3.HUVECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染SiRNA
　　H

24、UVECs用PA200的siRNA轉(zhuǎn)染以檢查其對(duì)洛伐他汀抑制蛋白酶體活性的作用。
　　4.蛋白酶體活性的檢測(cè)
　　通過用熒光酶標(biāo)儀在380/460nm，37℃下檢測(cè)游離的7-酰胺基-4-甲基香豆素，連續(xù)監(jiān)測(cè)蛋白酶體活性。
　　5.細(xì)胞和組織中ROS檢測(cè)
　　通過DHE熒光和高效液相色譜兩種方法測(cè)定培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS。將細(xì)胞與DHE(10M)共培養(yǎng)30分鐘，PBS沖洗后用甲醇提取，高效液相色譜法采用C-18列來

25、分離和量化氧代乙啶和溴化乙錠。O2-的產(chǎn)量取決于DHE和氧代乙啶之間的轉(zhuǎn)化。為了檢測(cè)動(dòng)脈原位的ROS產(chǎn)量，分離大鼠頸動(dòng)脈并將其立刻進(jìn)行冰凍切片，用10M DHE染色30分鐘，沖洗后，用熒光顯微鏡觀察。
　　6.RNA定量
　　使用基于Trizol的RNA分離方案提取總RNA。RNA通過Nanodrop定量。使用SuperscriptⅡ RT Kit對(duì)每個(gè)RNA樣品進(jìn)行cDNA合成，并使用Taqman PCR試劑進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚

26、合酶鏈反應(yīng)。
　　7.大鼠離體主動(dòng)脈環(huán)制備
　　通過靜脈注射戊巴比妥鈉(30mg/kg)在麻醉下處死大鼠。立即開胸取出降主動(dòng)脈，仔細(xì)分離血管周圍結(jié)締組織，將主動(dòng)脈切成3-4毫米長(zhǎng)的薄片。
　　8.糖尿病和高血脂模型的建立
　　對(duì)SD大鼠連續(xù)5天腹腔注射小劑量STZ(50 mg/kg/day)，損傷胰島細(xì)胞造成大鼠持續(xù)的高血糖，當(dāng)血糖大于300 mg/dl時(shí)認(rèn)定為糖尿病模型建立成功。用乙醚麻醉SD大鼠，自舌下靜脈注

27、射LDL溶液(4 mg/kg)建立大鼠高血脂模型。9.丙二醛(MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的測(cè)量
　　通過使用試劑盒推薦的方案測(cè)定主動(dòng)脈組織或血清中MDA含量，SOD活性和GSH-Px活性。
　　10.蛋白印跡(Western blot)
　　從不同組的細(xì)胞和主動(dòng)脈組織提取蛋白質(zhì)。通過Westernblot檢測(cè)PA200的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果
　　1.洛伐他汀上

28、調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中miR-29b表達(dá)
　　內(nèi)皮細(xì)胞中洛伐他汀對(duì)miR-29b的上調(diào)作用具有時(shí)間依賴性和劑量依賴性。
　　2.洛伐他汀可降低內(nèi)皮細(xì)胞中蛋白酶體活性
　　通過特定濃度的洛伐他汀作用內(nèi)皮細(xì)胞一定時(shí)間，我們確定了洛伐他汀在體外對(duì)蛋白酶體活性的下調(diào)作用。
　　3.miR-29b調(diào)控洛伐他汀抑制內(nèi)皮細(xì)胞蛋白酶體的活性
　　在scr-miR組，洛伐他汀明顯降低蛋白酶體活性，但是在anti-miR-29b組則無該

29、現(xiàn)象。在miR-29b過表達(dá)組，洛伐他汀對(duì)蛋白酶體活性的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)。
　　4.PA200是洛伐他汀處理的內(nèi)皮細(xì)胞中miR-29b的作用靶點(diǎn)
　　在轉(zhuǎn)染scr-miR慢病毒的內(nèi)皮細(xì)胞中，洛伐他汀顯著降低PA200蛋白水平。然而，轉(zhuǎn)染anti-miR-29b慢病毒組，洛伐他汀對(duì)PA200的下調(diào)作用消失;但pre-miR-29b慢病毒組，該作用顯著增強(qiáng)。
　　5.洛伐他汀對(duì)蛋白酶體的活性抑制是PA200依賴性的

30、>　　在空白載體組，洛伐他汀顯著降低蛋白酶體活性;但是在PA200過表達(dá)組，該抑制作用消失。沉默PA200可消除洛伐他汀對(duì)蛋白酶體的抑制作用。
　　6.阻斷miR-29b可消除洛伐他汀抑制高糖等多種心血管危險(xiǎn)因素誘導(dǎo)的ROS生成
　　通過檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)DHE熒光密度，發(fā)現(xiàn)包括ox-LDL、H2O2、TNF-α和HG在內(nèi)的多種心血管危險(xiǎn)因素顯著增加細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)物，而洛伐他汀可消除這些異?，F(xiàn)象。在轉(zhuǎn)染scr-miR慢病毒的細(xì)胞

31、內(nèi)，洛伐他汀降低ox-LDL和HG誘導(dǎo)的活性氧產(chǎn)物，并且這些抑制作用在轉(zhuǎn)染anti-miR-29b慢病毒的細(xì)胞中消失。
　　7.洛伐他汀在離體大鼠降主動(dòng)脈環(huán)中減輕多種氧化劑誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙
　　通過用ox-LDL的主要代謝產(chǎn)物L(fēng)PC、外生自由基DPPH、內(nèi)源性活性氧H2O2與大鼠主動(dòng)脈環(huán)孵育，發(fā)現(xiàn)這些氧化劑都損害乙酰膽堿引起的內(nèi)皮依賴性舒張。若用洛伐他汀預(yù)先處理主動(dòng)脈環(huán)，則可消除這些氧化劑引起的損害。
　　8.洛伐他

32、汀在體內(nèi)和體外均可改善HG引起的內(nèi)皮功能損害
　　HG降低離體鼠主動(dòng)脈環(huán)的乙酰膽堿依賴性血管舒張，而高滲刺激則無此作用。洛伐他汀處理使HG對(duì)血管舒張的抑制作用減弱，且該作用具有劑量依賴性。在注射STZ構(gòu)建1型糖尿病大鼠模型中，高血糖引起的內(nèi)皮功能損害可被洛伐他汀改善，且具有劑量依賴性。此外，經(jīng)洛伐他汀干預(yù)后，糖尿病大鼠血液中升高的MDA水平、降低的SOD活性和GSH-Px都可恢復(fù)。
　　9.洛伐他汀改善高血脂大鼠的內(nèi)皮功能損

33、害
　　在LDL注射前，分別用2mg/kg/d和4 mg/kg/d洛伐他汀預(yù)處理大鼠，可逆轉(zhuǎn)LDL引起的大鼠內(nèi)皮功能損害。此外，LDL引起的氧化應(yīng)激，如SOD活性降低、血清MDA水平增加也被洛伐他汀治療逆轉(zhuǎn)。
　　10.洛伐他汀減少糖尿病和高血脂模型大鼠體內(nèi)活性氧產(chǎn)物
　　心血管疾病危險(xiǎn)因素包括糖尿病和高血脂血癥，都顯著增加大鼠頸動(dòng)脈的活性氧產(chǎn)物，洛伐他汀治療后可消除大鼠體內(nèi)的這些異常。
　　研究結(jié)論