應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)(2D-DIGE)技術(shù)尋找SHR-SP腦卒中疾病相關(guān)蛋白.pdf

1、高血壓病(hypertension)發(fā)生率高，在中國(guó)成人高達(dá)18％，目前我國(guó)有1.6億高血壓病人。腦卒中(stroke)是高血壓病最重要的并發(fā)癥，中國(guó)高血壓病人腦卒中的發(fā)生率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于歐美國(guó)家的高血壓病人。中國(guó)腦卒中年發(fā)病率為2‰，每年新發(fā)140萬(wàn)，現(xiàn)有累計(jì)700多萬(wàn)患者。腦卒中一旦發(fā)生，后果嚴(yán)重，病人往往非死即殘。全球每年新發(fā)腦卒中1500萬(wàn)，其中500萬(wàn)人死亡，500萬(wàn)人永久性殘廢。中國(guó)每年死于腦卒中的人數(shù)約為140萬(wàn)。要使幸存者康

2、復(fù)，耗時(shí)費(fèi)力。中國(guó)每年因腦卒中直接支出374億人民幣。因此，就腦卒中而言，防止其發(fā)生比治療更重要。如何預(yù)防腦卒中的發(fā)生?除了降低血壓，目前尚無(wú)其他有效措施。甚至對(duì)于某些病例如缺血性腦卒中，降壓治療也并不能完全阻止腦卒中的發(fā)生。因此，有必要對(duì)腦卒中的病理生理機(jī)制進(jìn)行深入的研究，找出除了血壓以外的更多決定因素，針對(duì)這些因素進(jìn)行處理，提出新的防治策略，從而更好地預(yù)防腦卒中的發(fā)生，大幅度地降低腦卒中的危害。 腦卒中傾向的自發(fā)性高血壓大鼠

3、(Stroke-Prone Spontaneously Hypertensive Rats，SHR-SP)是目前研究腦卒中最常用的動(dòng)物模型，它是從自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats，SHR)里篩選出來(lái)、定向培育的亞種，具有自發(fā)性腦卒中傾向；換言之，并非所有的SHR都會(huì)發(fā)生腦卒中，SHR與SHR-SP同為高血壓動(dòng)物，但SHR-SP更易發(fā)生腦卒中，故采用SHR-SP與普通的SHR進(jìn)行比較研究，有

4、助于找到除了血壓以外的其他決定因子，闡明腦卒中發(fā)生的病理機(jī)制。 目前，對(duì)于某種疾病如腦卒中的研究多數(shù)只針對(duì)某種或某幾種血清或組織中的影響因素，這些因素是基于某種假定成立的預(yù)期理論而預(yù)先選定的，這些研究的目的也只是為了證實(shí)或者推翻這些假定的理論。然而，蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)這一強(qiáng)大技術(shù)手段的出現(xiàn)，打破了上述這些常規(guī)手段的限制，可一次檢測(cè)到成千上萬(wàn)種蛋白質(zhì)，不局限于任何既定的理論框架，有利于發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，新的現(xiàn)象

5、，以及新的作用機(jī)制。 近年來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)合生物信息學(xué)(bioinformatics)技術(shù)手段已經(jīng)廣為應(yīng)用。而相對(duì)于普通的硝酸銀染色，考馬斯亮藍(lán)染色等方法，雙向熒光差異凝膠電泳(twodimensional fluorescent difference gel electrophoresis，2D-DIGE)則更加具有其優(yōu)越性。2D-DIGE是唯一應(yīng)用內(nèi)標(biāo)(Internal Standard)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法，內(nèi)標(biāo)是從一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中

6、所有樣品選取等量蛋白混合而成的，將會(huì)出現(xiàn)在每一張膠上，并由配套的分析軟件以?xún)?nèi)標(biāo)為基準(zhǔn)分析所有檢測(cè)到的蛋白表達(dá)差異情況，大大提高了實(shí)驗(yàn)的可信度。此外，實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組以及內(nèi)標(biāo)組樣品分別由3種熒光標(biāo)記后混合，同時(shí)進(jìn)行一向和二向分離，最大程度的減少了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的系統(tǒng)誤差，提高了實(shí)驗(yàn)的可信度。因此，建立2D-DIGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)并應(yīng)用以比較分析SHR-SP與SHR蛋白質(zhì)表達(dá)、探求腦卒中發(fā)生發(fā)展新的內(nèi)在機(jī)制正是本課題的主要研究目的。 綜上所

7、述，本課題主要擬進(jìn)行以下幾個(gè)方面的研究： 1.2D-DIGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)的建立。 2.采用SHR-SP與普通的SHR進(jìn)行比較研究，應(yīng)用2D-DIGE技術(shù)分離SHR-SP與SHR的腦組織蛋白，選取差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，并用western blot進(jìn)行驗(yàn)證。 3.在上述結(jié)果的基礎(chǔ)上，深入分析差異蛋白在腦卒中發(fā)生中的作用。 具體實(shí)驗(yàn)及結(jié)果如下： 實(shí)驗(yàn)一：2D-DIGE技術(shù)平臺(tái)的建立。以SHR-

8、SP和SHR腦組織蛋白樣品為例，以CyDye進(jìn)行熒光標(biāo)記，隨后進(jìn)行雙向電泳分離蛋白，Typhoon Trio掃描獲得熒光圖像，配套的DeCyder分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，獲得差異蛋白信息。結(jié)果：成功的進(jìn)行了樣品的熒光標(biāo)記測(cè)試、熒光標(biāo)記及雙向電泳，并對(duì)掃描得到的圖像進(jìn)行了分析。即，成功建立了2D-DIGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)。 實(shí)驗(yàn)二：SHR-SP與SHR腦組織差異表達(dá)蛋白的尋找及驗(yàn)證。利用2D-DIGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)，比較分析SHR-SP

9、和SHR腦組織差異蛋白的表達(dá)。20周齡雄性SHR-SP和SHR，各5只，提取腦組織蛋白進(jìn)行雙向熒光差異凝膠電泳，獲得SHR及SHR-SP腦組織的差異蛋白表達(dá)譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在2000多個(gè)蛋白點(diǎn)中，找到44個(gè)顯著性差異表達(dá)的蛋白，其中19個(gè)在SHR-SP高表達(dá)，25個(gè)低表達(dá)。其中20個(gè)蛋白得到基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(MOLDI-TOF/TOF MS)鑒定，在鑒定到的差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)中，9個(gè)在SHR-SP中高表達(dá)，11個(gè)在SHR-S

10、P中低表達(dá)；其中抗氧化蛋白谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase，GST)在SHR-SP中顯著下調(diào)(P＜0.05)。Western Blot驗(yàn)證了這一結(jié)果，與2D-DIGE是一致的。 實(shí)驗(yàn)三：SHR-SP氧化應(yīng)激水平明顯高于SHR。既然抗氧化蛋白在SHR-SP顯著下調(diào)，我們比較了SHR-SP和SHR的氧化應(yīng)激水平。20周齡雄性SHR-SP和SHR，各10只，提取腦組織蛋白樣品及制備血清樣品，比較了

11、兩者抗氧化防御系統(tǒng)中總抗氧化能力(total antioxidant capacity，TAC)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathioneperoxidase，GPx)活性和丙二醛(maleic dialdehyde，MDA)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHR-SP腦中TAC和GPx均顯著低于SHR(12.47±3.02 vs22.73±3.00，P＜0.01；891.81±108.93 vs1124.4±160.06．P＜0.05)，而MDA含量

12、卻顯著高于SHR(1.11±0.11 vs0.82±0.11，P＜0.05)。血清中也得到了一致的結(jié)果，SHR-SP組TAC和GPx顯著低于SHR(61.28±15.16 vs123.6±32.39．P＜0.05；12.14±1.77 vs18.59±2.42，P＜0.05)，而MDA含量顯著高于SHR(13.33±2.90 vs5.89±1.21，P＜0.05)。 實(shí)驗(yàn)四：SHR-SP腦梗死面積明顯大于SHR。我們接下來(lái)比較了

13、SHR-SP和SHR的腦梗死面積。20周齡雄性SHR-SP和SHR，各15只，電凝法進(jìn)行大腦中動(dòng)脈栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)手術(shù)。術(shù)后24 h，行氯化三苯基四氮唑(2，3，5’-Triphenyl Tetramtlium Chloride，TTC)染色，計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)計(jì)算腦梗死面積百分比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SHR-SP腦梗死面積顯著高于SHR，兩者有顯著差異(23.0％±3.3％vs31.

14、6％±5.4％，P=0.004)。 實(shí)驗(yàn)五：維生素C和維生素E合用可以改善SHR-SP的氧化應(yīng)激水平、減小腦梗死面積。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測(cè)SHR-SP腦梗死嚴(yán)重可能與其氧化應(yīng)激損傷較嚴(yán)重有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證。我們選用最常見(jiàn)的抗氧化劑維生素降低氧化應(yīng)激水平，減少氧化損傷，再觀察腦梗死情況是否減輕。50只16周齡雄性SHR-SP隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組(n=25)和VCE組(Vitamin E(100mg/kg.d)+Vit

15、amin C(200mg/kg.d)，n=25)，連續(xù)灌胃4周。(1)4周后，檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)TAC、GP)和MDA，每組10只。結(jié)果顯示，VCE組腦中TAC和GPx活性均顯著高于對(duì)照組(25.57±6.68 vs12.47±3.02，P＜0.05；1453.11±126.98 vs891.81±108.93，P＜0.01)，MDA含量則顯著低于對(duì)照組(0.80±0.05 vs1.11±0.11，P＜0.05)。血清中得到了一致的結(jié)果，

16、VCE組TAC和GPx活性顯著高于對(duì)照組(124.75±28.43 vs61.28±15.16P＜0.05；19.63±4.84 vs12.14±1.77，P＜0.05)，MDA含量則顯著低于對(duì)照組(7.31±0.86 vs13.33±2.90.P＜0.05)。(2)余下的30只SHR-SP，其中15只連續(xù)給維生素4周，對(duì)照組給蒸餾水，4周后電凝法行MCAO手術(shù)。術(shù)后24 h，行TTC染色，計(jì)算機(jī)分析系統(tǒng)計(jì)算腦梗死面積百分比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，

17、VCE組腦梗死面積顯著低于對(duì)照組，兩者有顯著差異(20.8％±3.8％vs32.0％±4.9％，P=0.003)。 結(jié)論： 1.成功建立了2D-DIGE實(shí)驗(yàn)技術(shù)平臺(tái)，可以有效的進(jìn)行蛋白質(zhì)差異表達(dá)檢測(cè)。 2.應(yīng)用2D-DIGE技術(shù)手段獲得了SHR-SP和SHR腦組織的差異表達(dá)蛋白列表。其中，抗氧化蛋白在SHR-SP中顯著下調(diào)。 3.氧化應(yīng)激與腦卒中的發(fā)生有著密切關(guān)系，氧化應(yīng)激的增強(qiáng)是引起腦卒中的一個(gè)重要因素