白血病靶向治療與耐藥逆轉(zhuǎn)機(jī)制研究.pdf

1、目的：白細(xì)胞介素3受體α鏈(IL-3Rα鏈)即CD123抗原,是特異識(shí)別并結(jié)合白細(xì)胞介素3(IL-3)的關(guān)鍵部位,在急性髓系白血病(AML)干細(xì)胞表面高表達(dá),同時(shí)在正常造血干細(xì)胞表面幾乎不表達(dá)。力達(dá)霉素是烯乙二炔家族的一個(gè)新成員,主要由輔基蛋白和發(fā)色團(tuán)兩部分組成,可以拆分和重組,是一種新型高效的細(xì)胞毒藥物,已經(jīng)進(jìn)入Ⅱ期臨床。本實(shí)驗(yàn),希望結(jié)合二者的靶向和高效殺傷優(yōu)勢(shì),制備一種能夠針對(duì)AML干細(xì)胞的新型有效藥物。
　　 方法：利用D

2、NA重組方法構(gòu)建了一個(gè)以CD123為靶點(diǎn)、力達(dá)霉素為彈頭藥物的融合蛋白IL3-LDM,并采用蛋白質(zhì)譜與基因工程相結(jié)合的方法對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行鑒定和優(yōu)化改造,構(gòu)建mIL3-LDM。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)得到可溶性蛋白后,經(jīng)HIS6鎳柱純化,通過(guò)SDS—PAGE并western blot鑒定蛋白特性,通過(guò)BCA定量和IL3 ELISA定量確定蛋白產(chǎn)量及純度。流式細(xì)胞術(shù)(FACS)、熒光顯微鏡和激光共聚焦確定融合蛋白與CD123+的細(xì)胞系及病人臨床

3、標(biāo)本的結(jié)合活性后,CCK-8檢測(cè)該蛋白的細(xì)胞系殺傷效果,克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病人臨床標(biāo)本的干細(xì)胞殺傷率。
　　 結(jié)果：經(jīng)改造后的融合蛋白mIL3-LDM,穩(wěn)定性提升同時(shí)最大限度的保留了兩部分的全部活性。純化后的蛋白mIL3-LDM表達(dá)量約為1mg/l,純度可達(dá)95％,FACS測(cè)定融合蛋白與靶細(xì)胞的結(jié)合活性與CD123表達(dá)陽(yáng)性率成正比。體外,無(wú)論是細(xì)胞系還是AML病人細(xì)胞標(biāo)本,mIL3-LDM對(duì)CD123+的細(xì)胞系及AML干細(xì)胞均有很