青枯勞爾氏菌EP-1胞外多糖合成缺陷突變體篩選及生物學特征研究.pdf

1、青枯勞爾氏菌(Ralstonia solanacearum)，又稱青枯菌，起初命名為青枯假單胞桿菌（Pseudomonas solanacearum），革蘭氏陰性菌，是一種土傳植物細菌性青枯病的病原菌。青枯菌環(huán)境適應性強、寄主范圍廣，可危害40多個科的數(shù)百種植物，嚴重影響作物產量，對農業(yè)生產危害巨大。
　　本實驗利用廣東地區(qū)常見的強毒力青枯菌菌株EP-1構建Tn5插入突變體庫，在24,500個克隆中篩選得到15個胞外多糖明顯減少的

2、突變體，利用hiTAIL-PCR方法獲得突變基因的全序列，通過酶活生物測定、生物膜檢測、運動性檢測和接種試驗分析突變體的表型與致病性，進一步利用qRT-PCR技術分析相關基因表達量的差異，為進一步研究青枯菌胞外多糖致病性及調控機理和構建快速鑒定青枯菌致病力強弱的方法奠定基礎。結果如下：
　　1.篩選得到的15個胞外多糖明顯減少的突變體，分別命名為Em2、Em3、Em4、Em28、Em29、Em31、Em32、Em36、Em37、E

3、m51、Em56、Em58、Em60、Em61和Em64。另外，獲得青枯菌菌株EP-1、GMI1000、從番茄和花生分離得到的TM-1和PN-1菌株分別傳代培養(yǎng)至60代、25代和30代得到EP-60、GMI1000-25、TM-30和PN-30。
　　2.通過hiTAIL-PCR方法確定突變體插入基因位點。比對分析表明，突變體Em2、Em3、Em4、Em29、Em31和 Em37突變在相同基因 phcA的不同位點，該基因全長104

4、4bp，編碼347個氨基酸，是青枯菌致病性調控網(wǎng)絡的核心調控因子；突變體Em28突變在基因epsB中，該基因全長2256bp，編碼751個氨基酸，位于調控網(wǎng)絡下游，與其胞外多糖的分泌密切相關；突變體Em32突變在基因CMR15-30160中，該基因全長690bp，編碼229個氨基酸，具體功能未知；突變體Em36突變在基因gstO中，該基因全長690bp，編碼229個氨基酸，與谷胱甘肽轉移酶的合成有關；突變體 Em51突變在基因pstS2

5、中，該基因全長1062bp，編碼353個氨基酸，可能與磷酸鹽結合的周質前體ABC轉運蛋白的的合成有關；突變體Em56突變在基因asd中，該基因全長1104bp，編碼367個氨基酸，可能與天冬氨酸半醛脫氫酶氧化還原有關；突變體Em58突變在基因RSc1351中，該基因全長1245bp，編碼414個氨基酸，可能是組氨酸激酶跨膜轉錄調控蛋白感受器；突變體Em60突變在基因RSc1584中，該基因全長441bp，編碼146個氨基酸，推測為假定轉

6、錄調控因子；突變體Em61突變在基因RSc1620中，該基因全長243bp，編碼80個氨基酸，是假定跨膜蛋白；突變體 Em64突變在基因pckG中，該基因全長1869bp，編碼622個氨基酸，可能是磷酸羧化酶蛋白。
　　3.通過qRT-PCR檢驗分析表明，突變基因導致EP-1胞外多糖相關基因和編碼群體感應信號基因phcB的表達量降低；接種寄主植物表明致病性減弱，還對運動性及生物膜的形成產生影響。
　　4.初步建立了鑒定青枯菌