植物青枯菌VBNC狀態(tài)及相關(guān)基因rpoS生物學(xué)功能的研究.pdf

1、植物細(xì)菌性青枯病(bacterial wilt of plants)是由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum Yabuuchi et al，簡稱青枯菌）引起的一種重要土傳病害。國內(nèi)外研究表明，青枯菌在脅迫條件下可進(jìn)入活的非可培養(yǎng)狀態(tài)(viable but non-culturable，VBNC)。雖然國內(nèi)外已在硫酸銅、低溫、高溫誘導(dǎo)青枯菌VBNC狀態(tài)以及青枯菌VBNC檢測方面取得進(jìn)展，但尚未解析轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RpoS

2、與青枯菌VBNC的聯(lián)系以及在致病進(jìn)程中發(fā)揮的作用，也未建立適用青枯菌所有小種的PMA-qPCR檢測體系。本研究以青枯菌生姜分離菌株Z-Aq-1（以下簡稱Aq菌株）為研究對象，采用生物信息學(xué)、植物病理學(xué)、分子生物學(xué)和反向遺傳學(xué)等研究手段，構(gòu)建精準(zhǔn)高效的青枯菌活細(xì)胞檢測技術(shù)體系，探明青枯菌VBNC狀態(tài)形成與復(fù)蘇的誘導(dǎo)因子，解析轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子RpoS與青枯菌可培養(yǎng)/非可培養(yǎng)狀態(tài)間轉(zhuǎn)換、致病性等生物學(xué)表型間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)。旨在為病害早期診斷及病害流行

3、學(xué)規(guī)律研究提供技術(shù)支撐，為揭示VBNC狀態(tài)在青枯病侵染循環(huán)中的作用提供科學(xué)依據(jù)。
　　1.PMA-qPCR定量檢測青枯活菌方法的建立
　　通過單因素變化試驗對疊氮溴化丙錠(PMA)預(yù)處理體系中的各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確立了PMA預(yù)處理體系，PMA終濃度15ng/μL，黑暗孵育時間10min，曝光時間5min。將PMA與qPCR相結(jié)合，建立了一種適于所有青枯菌小種5×102～50×108cfu/mL范圍內(nèi)菌懸液活菌的檢測方法。

4、>　　2.rpoS基因突變菌株和互補(bǔ)菌株的構(gòu)建
　　基于NCBI中青枯菌UY031的全基因組序列，以rpoS基因為研究對象，采用同源重組的方法成功構(gòu)建rpoS基因突變載體及互補(bǔ)載體。通過自然轉(zhuǎn)化及抗性篩選成功獲得突變菌株AqΔrpoS，可能由于rpoS基因缺失的影響，通過自然轉(zhuǎn)化和電擊法均無法獲得互補(bǔ)菌株。
　　3.rpoS生物學(xué)表型功能驗證
　　致病力生物學(xué)測定結(jié)果表明，相比野生菌株具有強(qiáng)致病力，突變菌株完全喪失致病

5、力。定殖試驗結(jié)果表明，相比野生菌株在番茄根部和莖部定殖量高達(dá)1010cfu/g，突變菌株定殖能力顯著下降，接種過程中始終維持在2×108cfu/g水平以下。NB培養(yǎng)基中生長曲線結(jié)果顯示，與野生菌株相比，突變菌株在對數(shù)生長期的生長速率顯著減慢，而基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，突變菌株完全不能生長。Biolog代謝芯片測定結(jié)果表明，突變菌株與野生菌株在蔗糖、α-D-葡糖、果膠、D-果糖等幾種重要碳源的代謝上存在明顯差異。逆境脅迫生長測定結(jié)果表明，突變菌株在

6、酸性和高滲透壓條件下的生存能力均弱于野生菌株。耐藥性測足結(jié)果顯示，突變菌株對5種銅制劑的耐藥性均弱于野生菌株。運動性和生物膜測定結(jié)果表明，突變菌株的運動能力和生物膜形成能力均強(qiáng)于野生菌株。
　　4.青枯菌VBNC狀態(tài)的誘導(dǎo)和接種復(fù)蘇
　　銅離子誘導(dǎo)結(jié)果表明，突變菌株比野生菌株更快進(jìn)入VBNC狀態(tài)。低溫誘導(dǎo)結(jié)果表明，突變菌株比野生菌株提前60天進(jìn)入VBNC狀態(tài)。高溫誘導(dǎo)結(jié)果表明，48℃處理30min，突變菌株即可完全進(jìn)入VBN