馬鈴薯青枯病抗性相關(guān)基因的分離及其功能分析.pdf

1、馬鈴薯(Solanum mberosum L.)是繼小麥、玉米、水稻之后的世界第四大作物,在世界的食品安全體系中具有重要的作用.由青枯病菌Ralstonia solanacearum引起的馬鈴薯青枯病是僅次于馬鈴薯晚疫病的世界性病害,目前尚沒有行之有效的化學(xué)藥劑防治辦法,嚴重影響了馬鈴薯的生產(chǎn).培育抗病品種已成為防治馬鈴薯青枯病的根本手段.長期以來人們對馬鈴薯青枯病的研究和探討主要集中在病菌的病理學(xué)機制、分類學(xué)、流行病學(xué)等方面,而在馬鈴

2、薯本身的抗病遺傳特性、馬鈴薯青枯病抗性相關(guān)基因的種類、數(shù)量及其表達調(diào)控途徑等方面還不清楚.本研究旨在通過馬鈴薯青枯病抗性相關(guān)基因的分離和分析,初步揭示參與青枯病抗性的基因種類與數(shù)量,為進一步深入開展青枯病的抗病機制研究及利用抗性資源進行抗病品種選育奠定基礎(chǔ).主要研究結(jié)果如下:1.建立了快速可靠的馬鈴薯抗青枯病鑒定新方法,并篩選出了13份抗或高抗青枯病和高感青枯病的二倍體材料.采用傳統(tǒng)方法和改進方法對馬鈴薯二倍體CE和ED群體、番茄抗病和

3、感病品系進行了青枯病抗性鑒定和評價,建立了更加簡便快速、經(jīng)濟和可重復(fù)的病菌鑒定新方法一莖枝菌液共培養(yǎng)法,該方法對于茄科作物的種質(zhì)資源抗病性評價和篩選,特別是對于病菌誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性的抗(感)病植株的快速鑒定及其幼苗的先期快速篩選具有重要意義.同時利用該方法篩選出了6份抗或高抗青枯病材料和7份高感青枯病材料(見表2.4),其中6個材料(如高抗青枯病基因型ED13、高感青枯病基因型ED25等)已被用于親本構(gòu)建作圖群體,為今后開展馬鈴薯的抗病遺傳

4、研究奠定了基礎(chǔ).2.建立了富集差異表達基因的SSH文庫并獲得了44個病菌侵染早期馬鈴薯抗青枯病相關(guān)基因.以抗青枯病二倍體基因型ED13為材料,青枯病菌小種3號P041為供試菌株,利用抑制差減雜交(SSH)和微陣列雜交篩選技術(shù)相結(jié)合,獲得了123個差異表達的非重復(fù)的早期抗病相關(guān)基因EST片段,其中99個(80﹪)EST可找到與其具有較高同源性的序列(O),16個(13﹪)可找到較低同源性的序列(E-值>10<'-

5、10>.),8個(7﹪)無同源序列.這些無同源序列或具有較低同源性的序列可能代表新基因.在123個差異表達的EST中,除22﹪的功能未知或已知功能而未分類和8﹪的無同源序列外,其余70﹪的EST分屬于初級代謝、能量代謝、細胞結(jié)構(gòu)、調(diào)控、蛋白合成/修飾/加工、轉(zhuǎn)運相關(guān)、抗病防御、轉(zhuǎn)錄相關(guān)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程. 在獲得的123個差異表達EST中,至少有44個(約35.8﹪)參與了馬鈴薯的抗青枯病反應(yīng).這些EST對應(yīng)的基因涉及到信號識

6、別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、過敏(HR)反應(yīng)、系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)、細胞自救與抗病防御等抗病反應(yīng)的基本過程.這些抗病相關(guān)基因中大部分與已知基因高度同源,預(yù)示著這些基因較為保守,在不同植物種的抗病反應(yīng)中可能具有重要的作用.3.構(gòu)建了一個富集青枯病抗性相關(guān)基因的SMART cDNA文庫.以青枯病菌小種3號(P041)誘導(dǎo)24 h和148 h的馬鈴薯高抗青枯病二倍體基因型ED13的葉片為材料,利用SMART和LD-PCR技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了一個富

7、集青枯病抗性相關(guān)基因的全長cDNA文庫,為進行重要基因全長cDNA的克隆奠定了基礎(chǔ).所建文庫的原始文庫和擴增文庫滴度分別為4.4×10<'6>和1.8×10<'10>pfu/ml,重組率為96﹪,插入片段大小分布在400-1800 bp,平均大小為700-1000 bp.4.獲得了三個基因的全長cDNA、四個基因的RACE產(chǎn)物及它們的誘導(dǎo)表達模式.利用RAcE與LD-PCR方法和cDNA文庫相結(jié)合,快速獲得了三個具有完整開放閱讀框架基因

8、的全長cDNA(StPI、StPMEI和StDnaJ)和四個抗病相關(guān)基因(L51、L77、L181和L362)cDNA的5'和3'RACE的PCR產(chǎn)物,同時研究了這些基因的誘導(dǎo)表達.具體為: StPI編碼116個氨基酸,與馬鈴薯蛋白酶抑制子I前體cDNA有較高的同源性(核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為89﹪和74﹪).該基因受青枯病菌的誘導(dǎo)和JA的調(diào)節(jié),均為上調(diào).推測StPI基因是馬鈴薯蛋白酶抑制子基因家族的重要成員,在馬鈴薯的

9、抗青枯病的反應(yīng)中可能具有重要作用.該基因已在GenBank注冊,序列號為DQ822994. StPMEI編碼198個氨基酸,與煙草果膠甲脂酶抑制子基因具有較高的同源性(核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為85﹪和78﹪).StPMEI基因的表達受青枯病菌侵染的抑制,可能與病菌侵染早期促使果膠甲脂酶(PME)表現(xiàn)活性,加固細胞壁有關(guān);但該基因又受JA的誘導(dǎo)可能與病菌侵染后期細胞壁的擴展和新細胞壁的建立有關(guān).該基因已在GenBank注冊

10、,序列號為DQ822993. StDnaJ編碼177個氨基酸,與擬南芥DnaJ-like基因的部分核苷酸具有84﹪的一致性,與其編碼的氨基酸序列具有59﹪的一致性.該基因受青枯病菌的誘導(dǎo),也受JA的調(diào)節(jié).但JA誘導(dǎo)后其上調(diào)表達明顯比青枯病菌誘導(dǎo)提前,且其維持高表達水平的時間也明顯縮短.該基因已在GenBank注冊,序列號為DQ885360. L51(methyl-CpG-binding domain-containing

11、 protein)和L77(putatively encoding receptor-1ikekinase RHGl)均受青枯病菌的誘導(dǎo),但它們的受誘導(dǎo)速度不同.L51在6-12小時內(nèi)表達量即達到最高;L77約需48小時才可達到最高表達量.這兩個基因均不受JA的調(diào)節(jié). L181(phosphatase 2C)同時存在于抗病基因型和感病基因型中,在抗病基因型ED13中受青枯病菌的誘導(dǎo)下調(diào)表達,與此相反卻受JA的誘導(dǎo)上調(diào)表達;在感病

12、基因型ED25中,該基因不受JA調(diào)節(jié).預(yù)示著對于L181而言,病菌處理和JA刺激可能采用不同的調(diào)節(jié)途徑,并且該基因在抗病材料中因受誘導(dǎo)下調(diào)表達而參與抗病反應(yīng). L362(protein kinase Ptil)同時受青枯病菌的誘導(dǎo)和JA的調(diào)節(jié),其表達模式與StDnaJ相似,均為上調(diào)表達.在處理24小時之前該基因的mRNA積累量即達到最高,并且L362在JA誘導(dǎo)后其上調(diào)表達明顯比青枯病菌的誘導(dǎo)提前.Ptil基因為Pro基因的下游基