番茄抗青枯病的AFLP分子標記及其相關(guān)基因的克隆.pdf

1、茄科植物細菌性青枯病是一種廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶等溫暖濕潤的地區(qū)的土傳性病害，是多種農(nóng)作物減產(chǎn)的主要原因。該病可危害以茄科為主的44個科的300多種植物。我國福建、廣東、臺灣、廣西、四川、云南、湖南、江西、浙江、上海、江蘇、安徽等省市(區(qū))都有分布。一般以番茄、馬鈴薯、茄子、芝麻、花生、大豆、蘿卜、辣椒等茄科蔬菜以及煙草、桑、香蕉等經(jīng)濟作物受害較重。在番茄生長過程中經(jīng)常受到青枯病的危害，特別在番茄結(jié)果期，適逢高溫高濕的雨季，可引起

2、毀滅性的危害。由于迄今尚未找到防治此病的有效方法，所以對青枯菌的致病機理和植物對此病的抗病機制的研究越來越受到人們的關(guān)注。 (1)通過測量菌株生長過程中上清液的OD值及EPSI、果膠酶和纖維素酶的變化來檢測不同菌株致病力，在6個致病性力不同的菌株中篩選出了一個強致病力青枯病菌FJ，在番茄中的致病性檢測表明，各菌株在致病性上存在一定差異，F(xiàn)J的致病性最強，發(fā)病率達到了100％，病情指數(shù)達到了100。導致菌株致病力降低的原因是由于實

3、驗室長期保存致病力強的菌株慢慢分化為無致病力的菌株。 (2)利用篩選出的強致病力青枯菌FJ對不同番茄品種進行接菌抗病性檢測，篩選到了兩個感病品種T9230和T903，他們的發(fā)病率都達到100％，平均病情指數(shù)分別為98.54和91.77，二者在平均發(fā)病率上沒有顯著性差異，但病情指數(shù)上在0.05和0.01水平上都有顯著性差異；篩選到了T9178、T0504C和T9176三個中間類型的品種，他們的平均病情指數(shù)在20-60之間；還篩選到

4、了三個抗病品種T01254、T01028和T51A，他們的病情指數(shù)都小于20，其中T51A的抗性最強，平均病情指數(shù)為3.96。 (3)利用T51A和T9230進行雜交，對其后代植株的抗病性表現(xiàn)進行遺傳分析，結(jié)果表明番茄植株在接菌后表現(xiàn)為抗病對感病為不完全顯性，可能受細胞質(zhì)控制遺傳，受兩對雜合基因控制，二者之間有互補作用。 為了尋找與抗病相關(guān)的分子標記，我們利用DNA-AELP技術(shù)和改良的DNA提取方法，選擇了16條Eco

5、RI引物和16條MseI引物相互組合，在親本T51A和T9230間總共擴增出的條帶約有19,200條，122個引物組合(占引物組合數(shù)的47.66％)在抗病親本池(BA)和感病親本池(BB)之間擴增出了238條差異帶，平均每條引物擴增1.95條差異帶。利用在兩親本池之間產(chǎn)生差異條帶的122個引物組合在F2抗病池(BR)和)感病池(Bs)間進行篩選，只有13個引物組合在BR和Bs池間擴增到了13條差異條帶，這13個引物組合在300個F2代單

6、株中進行擴增，共找到了兩個與抗病相關(guān)的分子標記(T-E2M4 和 T-E10M13)，并把序列提交到NCBI上，登陸號分別為EU260055和EU2600556，序列比對發(fā)現(xiàn)EU260055序列沒有找到相似度較高的序列，EU260056序列與葉綠體上的rrn4.5基因有關(guān)。 根據(jù)AFLP標記T-E2M4和T-E10M13的序列設(shè)計引物，成功將AFLP標記轉(zhuǎn)換為SCAR標記，利用Mapmaker/exp 3.0發(fā)現(xiàn)兩個SCAR標記

7、與抗病基因TRSR-1的遺傳距離分別為4.6 cM和8.4 cM。 (4)我們用Trizol試劑提取RNA后利用CLONTECH公司的SMART cDNA Library Construction Kit合成cDNA，從抗病親本T51A和感病親本T9230中分別隨機挑選10個抗病單株和10個感病單株的DNA等質(zhì)量混合構(gòu)建抗病親本cDNA池(cBA)和感病親本cDNA池(cBB)。從F2代中同樣用BSA法挑選1O個高抗和高感植株的

8、cDNA等量混合構(gòu)建F2抗病池(cBR)和感病池(cBs)。四個池的cDNA用來做進一步的cDNA-AFLP分析。 通過對256對EcoRI和MseI引物組合進行轉(zhuǎn)錄譜AFLP分析，共檢測到了約30000個清晰可見的轉(zhuǎn)錄基因片段，擴增片段長度大多在50-500bp。在cBA和cBR池擴增出來而在感病親本cDNA池cBB和F2感病池cBs擴增不出來的差異片段，肉眼可分辨的有525條，對其中215條表達比較強的差異片段進行回收、克隆

9、并測序，成功測序的有102條，經(jīng)RT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)11條為假陽性片段，其余的91條DE-TDFs序列經(jīng)序列比對按其功能類別可以分為9類，大部分與脅迫反應(yīng)(27個DE-TDFs，占29.67％)和代謝(19個DE-TDFs，占20.88％)相關(guān)，其余的為未知或假定蛋白(11個DE-TDFs)，信號轉(zhuǎn)導(8個DE-TDFs)、跨膜通道(7個DE-TDFs)、Phage(3個DE-TDFs)、蛋白相互作用(4個DE-TDFs)和轉(zhuǎn)錄因子(

10、2個DE-TDFs)相關(guān)，無相似序列的有7個DE-TDFs。 (5)在用引物組合E12M7進行cDNA-AFLP分析時，發(fā)現(xiàn)了一條長度為300bp左右的片段在抗病池中有表達，而在感病池中沒有表達，這個片段長度為303 bp，將片段DE-TDF058的序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行比對發(fā)現(xiàn)與基因CCoAOMT有很高的同源性。根據(jù)馬鈴薯和煙草的CCoAOMT基因CDS設(shè)計引物P3/P4在番茄中進行擴增，得到了一個包括起始密碼子AT

11、G和終止密碼子TAA在內(nèi)的長為729 bp的序列，一共編碼242個氨基酸，此全長序列已經(jīng)提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，登陸號為：EU161983，其DNA全長為816 bp，具有4個內(nèi)含子，分別為23 bp，15 bp，22 bp和27 bp。將番茄CCoAOMT基因的核苷酸序列與其他茄屬植物的CCoAOMT基因的核苷酸序列進行Blast比對發(fā)現(xiàn)，與馬鈴薯、煙草的CCoAOMT基因，有很高的相似度。CCoAOMT基因推導的蛋白含有Methyl

12、transf_3保守區(qū)域，屬于pfam01596，Methyltransf_3，氧甲基轉(zhuǎn)移酶，可能參與抗生素的產(chǎn)生，細胞壁的合成，響應(yīng)逆境傷害如病原菌侵染等。 根據(jù)CCoAOMT基因序列設(shè)計引物q1/q2，對番茄不同抗青枯病品種T51A、T01028、T01254和秘魯番茄(T1364)；感病品種T9230、上海合作(Hezuo)和T9178；中間類型T9176和T0504C分別在接菌前后進行擴增。結(jié)果顯示，所有品種在接菌前都能

13、擴增到一個約730 bp的條帶，接菌之后抗青枯病番茄品種都能擴增到比較強的條帶，中間類型的品種擴增到的條帶比較弱，感病品種不能擴增到條帶。在感病品種中，接菌后可能抑制了CCoAOMT基因的表達，從而降低了木質(zhì)素的合成，表現(xiàn)為感病。 (6)對不同抗性水平的番茄品種進行青枯菌接種試驗，測定根葉中與抗病相關(guān)的PAL、SOD酶活性及生化物質(zhì)木質(zhì)素和總酚含量的變化，結(jié)果表明，抗病品種T51A的PAL酶活性明顯高于中間類型品種T9178，T

14、9178的PAL活性高于感病品種T9230，接菌后，各品種的PAL，活性迅速上升，其中抗病品種T51A上升的幅度最大，速度最快； 未接種各番茄品種的根部和葉片SOD活性交化幅度不大，接菌之后各品種的SOD活性均顯著上升，抗病品種T51A的活性大于T9178的活性和T9230的活性，在達到最高峰后各品種的SOD活性一直下降，除T9230最后的SOD活性比對照低外，T51A和T9178最后的活性均比對照高。 未接菌的番茄品種

15、木質(zhì)素含量變化不大，但抗性高的含量比抗性低的高；接菌之后各品種的根部及葉片中的木質(zhì)素含量都顯著增加，但抗性高的T51A增加的最快，增加的也最多，而感病品種T9230的增幅較小，這說明木質(zhì)素含量與番茄品種抗青枯病有關(guān)系。 不同抗性類型的番茄品種在接菌之后，根部和葉片中總酚含量都增加，其中抗病品種T51A的增幅最大，呈現(xiàn)雙峰曲線，但其含量含量始終高于中間類型T9178和感病品種T9230；中間類型品種T9178的趨勢同T51A，在第