花生抗青枯病的分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究.pdf

1、花生(Arachis hypogaeaL.)是世界上重要的經(jīng)濟(jì)作物和油料作物。由茄科雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）侵染花生引起的青枯病(Bacterial Wilt)是影響熱帶、亞熱帶以及部分溫帶地區(qū)花生生長(zhǎng)的重要細(xì)菌性病害；在我國(guó)尤以長(zhǎng)江流域以及南方地區(qū)較為嚴(yán)重。作為一種土傳性病害，花生青枯病目前尚沒(méi)有有效的化學(xué)防治手段，與其他作物輪作、間套作及利用生物防治等防治效果也非常有限，因此防治花生青枯病的根本手段還

2、是培育抗病品種。但是由于缺少優(yōu)良的抗病基因源、抗性表現(xiàn)受環(huán)境影響較大以及青枯菌菌系分化的復(fù)雜性等，都嚴(yán)重影響了花生抗病育種進(jìn)程。由于青枯雷爾氏菌復(fù)雜的多態(tài)性、田間鑒定結(jié)果的不穩(wěn)定性，岡此尋求快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確而不受時(shí)間限制的室內(nèi)接種鑒定方法則顯得非常重要。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)花生青枯病的研究不多，控制花生對(duì)青枯病抗性的基因種類和數(shù)量以及它們的表達(dá)調(diào)控機(jī)制還不清楚，花生抗青枯病的分子生物學(xué)研究基礎(chǔ)還比較薄弱。本研究建立了簡(jiǎn)便快速的花生青枯病的抗性鑒

3、定方法，構(gòu)建了受青枯菌誘導(dǎo)的花生根全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，也構(gòu)建了攜帶擬南芥抗青枯病基因RRS1的表達(dá)載體，為了解花生青枯菌的侵染和花生抗青枯病機(jī)理，奠定前期工作基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：
　　 1．選取不同的花生青枯菌菌株，采用傷根灌菌液法接種中感品種閩花6號(hào)，測(cè)定菌株的致病力差異，菌株431致病力較強(qiáng)，是理想的接種菌株。通過(guò)比較幾種不同的侵染方法接種花生，觀察了抗感品種的發(fā)病情況，確定了較為理想的抗性鑒定方法。傷根灌菌液法雖然能夠反映品

4、種的抗性，但是由于菌液接種量大、發(fā)病周期較長(zhǎng)給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)了許多不便；葉腋注射法不能反映品種的抗感性，而且操作繁瑣，我們不予采納：剪葉法接種后25d就能反映出品種的抗性，發(fā)病周期短，而且操作性強(qiáng)以及接種量小，是理想方便的接種方法?？傊瑐嗑悍ê图羧~法都能說(shuō)明品種的抗性，剪葉法優(yōu)于傷根灌菌液法。
　　 2．通過(guò)傷根灌菌液法接種抗青枯病品種閩花8號(hào)，利用SMART技術(shù)構(gòu)建了受青枯菌誘導(dǎo)的花生根處理和對(duì)照全長(zhǎng)cDNA混合文庫(kù)。初級(jí)文

5、庫(kù)滴度為1.902×106cfu/m1，插入率99％，插入片段大小在500～2500bp之間，平均為1200bp;擴(kuò)增文庫(kù)滴度為9.68×1011cfu/ml。從文庫(kù)中隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行兩端測(cè)序，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析45％的序列為預(yù)測(cè)蛋白，功能未知，這說(shuō)明花生基因組學(xué)研究相對(duì)薄弱。隨機(jī)挑取74個(gè)克隆進(jìn)行兩端測(cè)序，利用BLAST2GO軟件進(jìn)行注釋和功能分析。序列經(jīng)注釋后功能分析將已知功能的EST按照細(xì)胞組分、分子功能和參與生物過(guò)程分為三

6、大類，在細(xì)胞組分一類中，大多數(shù)被歸類為線粒體(mitochondrion)和細(xì)胞質(zhì)膜(plasma membrane)兩類；在分子功能的分類中，結(jié)合(binding)和催化活性(catalytic activity)居多；在生物過(guò)程的分類中，分為代謝過(guò)程(metabolic process)和細(xì)胞過(guò)程(cellular process)的比較多。物種相似性分布分析與水稻、葡萄、擬南芥較為相似，說(shuō)明花生上仍有大量的待發(fā)掘功能基因。

7、　　 3．根據(jù)已經(jīng)登錄的RRS1-R基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RT-PCR從擬南芥Nd-1中克隆得到4137bp的抗青枯病基因RRS1-R，與GenBank上登錄的原序列同源性達(dá)99％，將該基因片斷連入植物表達(dá)載體pSC1301，構(gòu)建帶抗青枯病基因的植物表達(dá)載體pSC1301-RRS1，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。然后準(zhǔn)備對(duì)煙草進(jìn)行了遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)而進(jìn)行功能驗(yàn)證，后續(xù)工作正在進(jìn)行中。
　　 本項(xiàng)目還同時(shí)開展了花生對(duì)青枯病的抗性遺傳和抗性基