鈣磷降解材料生物礦化的細(xì)胞分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究.pdf

1、生物醫(yī)用材料是材料科學(xué)技術(shù)的一個(gè)分支，相關(guān)研究涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最基本的科學(xué)問題。為了探討無生命的物質(zhì)參與構(gòu)建有生命組織的機(jī)制，開展了鈣磷降解材料生物礦化的細(xì)胞分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究。 設(shè)計(jì)并建立了細(xì)胞培養(yǎng)→基因克隆→基因表達(dá)→蛋白質(zhì)純化→蛋白質(zhì)分子與材料作用的系統(tǒng)研究模式。首先采用酶消化法和植塊法從Wistar乳鼠顱骨體外分離培養(yǎng)了大鼠成骨細(xì)胞，兩種方法獲得的成骨細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)和純化后，顯示出高的堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力，具

2、有良好的生物學(xué)特性。將原代培養(yǎng)后傳至第3代、經(jīng)過純化、狀態(tài)良好的成骨細(xì)胞進(jìn)行凍存，復(fù)蘇后存活率達(dá)93％，堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，有鈣結(jié)節(jié)形成，可擴(kuò)增堿性磷酸酶基因，與未凍存細(xì)胞比較，復(fù)蘇細(xì)胞的生物學(xué)特性無明顯改變； 設(shè)計(jì)了一對(duì)PCR反應(yīng)特異性引物F1、R1，從酶消化法分離培養(yǎng)的Wistar乳鼠成骨細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出骨粘連蛋白的編碼區(qū)cDNA序列，將PCR產(chǎn)物插入pBS-T載體，測(cè)序并與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，其序列與Ge

3、nBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的一致； 將大鼠骨粘連蛋白基因重組到原核表達(dá)載體pGEX-KG中，構(gòu)建了正確的表達(dá)載體pGEX-KG/ON，在大腸桿菌E.coliBL21(DE3)pLysS中實(shí)現(xiàn)了全長(zhǎng)表達(dá)，表達(dá)的融合蛋白存在于細(xì)菌裂解液上清中，上清中的目的蛋白采用硫酸銨分級(jí)沉淀、超濾膜分離、GST親和層析逐步純化，獲得了高純度的大鼠骨粘連蛋白； 將大鼠成骨細(xì)胞與鈣磷材料混合培養(yǎng)，顯微鏡下可觀察到成骨細(xì)胞對(duì)鈣磷材料有明顯的吞噬

4、作用；細(xì)胞計(jì)數(shù)、MTT和CKK-8等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，鈣磷材料有利于成骨細(xì)胞增殖； 將骨粘連蛋白與Ca2+離子作用，采用等離子體發(fā)射光譜儀進(jìn)行檢測(cè)，證明所獲得的骨粘連蛋白可結(jié)合鈣離子；骨粘連蛋白與鈣磷材料作用后，SEM、XRD、XPS測(cè)試結(jié)果顯示，蛋白在鈣磷材料表面發(fā)生了吸附和鍵合反應(yīng)。骨粘連蛋白通過Ca2+離子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合Ca2+，通過-NH3+結(jié)合PO43-，并啟動(dòng)羥基磷灰石晶核形成，以高的親和力吸附羥基磷灰石晶核后，從材料表面