熒光定量PCR檢測(cè)嵌合率及微小殘留病方法的建立及與復(fù)發(fā)關(guān)系的相關(guān)性研究.pdf

1、白血病(Leukemia)是在造血干/祖細(xì)胞水平轉(zhuǎn)化的一類克隆性惡性血液病。在惡性腫瘤中，其死亡率在男女性分居第6位和第8位，而在青壯年人群中則是威脅生命安全的首要原因，因而越來(lái)越受到全世界人們的重視，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。白血病的治療方法包括最基本的聯(lián)合化療及造血干細(xì)胞移植。目前聯(lián)合化療對(duì)初治白血病的臨床緩解率可以達(dá)到80％-90％，造血干細(xì)胞移植的成功率也在不斷提高。但是復(fù)發(fā)仍然是白血病治療失敗的主要原因。對(duì)于治療失敗的患者來(lái)說，復(fù)發(fā)

2、的根源在于體內(nèi)殘留的白血病細(xì)胞，而對(duì)于移植的患者供體細(xì)胞嵌合率也與移植后的復(fù)發(fā)有著緊密的聯(lián)系。 異基因造血干細(xì)胞移植(allo-HSCT)是多種血液系統(tǒng)疾病及自身免疫疾病的重要治療手段，而移植成功與否與供體細(xì)胞在受者體內(nèi)的植入方式一嵌合狀態(tài)(chimerism)的形成和發(fā)展有關(guān)。廣義的講，任何非己成分與自身成分共存的現(xiàn)象，都是嵌合狀態(tài)，但在移植耐受中，嵌合狀態(tài)是指血細(xì)胞的嵌合。研究表明allo-HSCT后受者體內(nèi)細(xì)胞的存在方式有

3、以下幾種。①完全嵌合狀態(tài)(completechimerism，CC)即供者細(xì)胞完全植入，代替了受者細(xì)胞；②混合嵌合狀態(tài)(mixedchimerism，Mc)即供受者細(xì)胞同時(shí)存在于受者體內(nèi)；③完全受者型(recipientcomplete RC)即供者的細(xì)胞逐漸被排斥或者消失。幾種嵌合狀態(tài)中，多認(rèn)為以CC為好，MC與臨床復(fù)發(fā)的關(guān)系尚存在爭(zhēng)議，一般認(rèn)為移植后受者細(xì)胞比例逐漸增加或CC后再重新檢測(cè)到受者細(xì)胞成分可能預(yù)示疾病晚期復(fù)發(fā)。因此嵌合體

4、分析已成為一種證實(shí)植入的常規(guī)方法。目前檢測(cè)嵌合狀態(tài)的主要方法均是利用了DNA的多態(tài)性，包括①可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable numbers of tardemrepeats，VNTR)又稱小衛(wèi)星(minisatellite)。②短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandemrepeats，STR)又稱微衛(wèi)星(microsatellite)。這種方法是目前最常用的方法且具有很高的準(zhǔn)確性。③限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RELP)。④缺失或插入雙

5、等位基因多態(tài)性(Indels)和單鏈核苷酸多態(tài)性(SNPs)。Indels和SNP的多態(tài)性分析均可以用熒光定量方法進(jìn)行，因此利用Indels和SNP的多態(tài)性可以把熒光定量PCR技術(shù)引入嵌合體的檢測(cè)，以提高靈敏度和準(zhǔn)確度。 慢性粒細(xì)胞白血病，是伴有獲得性染色異常的多能干細(xì)胞水平上的惡性變引起的一種惡性血液病。Ph染色體是慢粒的特異性染色體畸變，95％以上的本病患者存在t(9；22)(q34；q11)，形成bcr/abl融合基因，編

6、碼產(chǎn)生P210蛋白，P210蛋白能夠增強(qiáng)酪氨酸激酶的活性，導(dǎo)致粒細(xì)胞轉(zhuǎn)化和過度增殖，從而導(dǎo)致慢粒。格列衛(wèi)是一種專門針對(duì)Ph染色體陽(yáng)性白血病的特異性藥物，主要功能是抑制酪氨酸激酶的活性，已用于慢粒的臨床治療。根據(jù)上述原理，bcr/abl融合基因的表達(dá)變化情況既可以反映患者體內(nèi)殘留的白血病細(xì)胞水平，同時(shí)可反映臨床治療比如格列衛(wèi)的效果。目前尚未見格列衛(wèi)治療期間bcr/abl融合基因的表達(dá)變化情況的動(dòng)態(tài)觀察報(bào)道。 本文的實(shí)驗(yàn)?zāi)康陌?

7、①建立造血干細(xì)胞移植后熒光定量PCR檢測(cè)嵌合狀態(tài)的相對(duì)定量方法，以及RQ-RT-F)CR監(jiān)測(cè)殘留白血病的絕對(duì)定量方法。②利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)移植后供體細(xì)胞嵌合率以及慢粒應(yīng)用格列衛(wèi)治療前后的BCR/ABL融合基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)，并分析了其相關(guān)性，為臨床監(jiān)測(cè)白血病的復(fù)發(fā)提供理論依據(jù)。 第一部分：熒光定量PCR檢測(cè)移植后嵌合體方法的建立及與復(fù)發(fā)的相關(guān)性研究 近來(lái)在人類基因組中，許多具有缺失或插入多態(tài)性的雙等位基因

8、被發(fā)現(xiàn)。利用這種多態(tài)性作為區(qū)別不同個(gè)體的基因marker，我們建立了檢測(cè)移植后嵌合率的熒光定量PCR方法。首先在基因庫(kù)中選擇了具有缺失或插入多態(tài)性的四條基因，SRY、Xq28、GSTMl、GSTT1。其中SRY僅在男性體內(nèi)存在，Xq28、GSq、M1、GSTT1的缺失率文獻(xiàn)報(bào)道分別為(30％、47％、17％)。分別在四條基因的缺失序列上設(shè)計(jì)引物及探針，同時(shí)也為管家基因β-globin設(shè)計(jì)好引物及探針。選取臨床患者外周血標(biāo)本，常規(guī)方法提取

9、DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩ｋS機(jī)選擇備用DNA標(biāo)本，分別對(duì)SRY、Xq28、GSTM1、GSTT1及管家基因β-globin進(jìn)行定性PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠純化、回收目的產(chǎn)物，連接T載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，LB培養(yǎng)基，37C°，150rpm震蕩14-16小時(shí)，提取質(zhì)粒測(cè)濃度后備用。質(zhì)粒同時(shí)送三博公司測(cè)序。將不同基因的質(zhì)粒按2倍倍比稀釋后進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，作出各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到各基因的擴(kuò)增效率E。文中17例標(biāo)本為供

10、受者性別不符，用SRY基因進(jìn)行檢測(cè)。14例供受者性別相符標(biāo)本在預(yù)試驗(yàn)中已驗(yàn)證可用Xq28、GSTM1、GSTT1三種基因?qū)┦苷哌M(jìn)行區(qū)分。以移植前目的基因與管家基因的比值為原始參照，移植后不同時(shí)間點(diǎn)的相應(yīng)值與之進(jìn)行比較得到數(shù)據(jù)。并與STR方法的結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果證明該方法敏感性可達(dá)10<'-4>-10<'-5>,結(jié)果與STR相比基本一致，但該方法更準(zhǔn)確、快速、敏感。移植后復(fù)發(fā)患者的嵌合率在不同時(shí)間段的檢測(cè)結(jié)果具有明顯的下降趨勢(shì)，差異具

11、有顯著性(P<0.05)。這種趨勢(shì)在外周血與骨髓中是一致的，但骨髓較外周血提前，因此嵌合率的下降可預(yù)示復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)多發(fā)生在移植后60天左右。 第二部分：熒光定量PCR檢測(cè)BCR/ABL融合基因方法的建立及該融合基因mRNA表達(dá)水平的變化與CML患者格列衛(wèi)治療效果的相關(guān)性研究 Ph染色體是慢粒的特征性染色體畸變，9號(hào)染色體和22號(hào)染色體長(zhǎng)臂的異位導(dǎo)致位于9號(hào)染色體上的BCR基因與位于22號(hào)染色體上的ABL基因融合形成BCR/

12、ABL融合基因。這種融合基因共有三種融合類型，b2a2，b3a2，ela2，其中前兩種類型可覆蓋95％的慢性粒細(xì)胞白血病患者，不僅可以用來(lái)輔助臨床診斷，還可以用來(lái)監(jiān)測(cè)患者體內(nèi)的殘留白血病細(xì)胞，從而預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)。本章建立一種可以特異的對(duì)b2a2，b3a2兩種類型融合基因進(jìn)行檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。選擇K562細(xì)胞系，常規(guī)方法提取RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在兩種類型的融合基因的共有區(qū)域設(shè)立上下游引物和探針，進(jìn)行BCR/ABL以及管家基因GA

13、DPH的定性PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，之后將目的條帶切下利用試劑盒將目的基因序列純化回收。將BCR/ABL序列和GADPH與PGM-T載體連接形成質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，LB培養(yǎng)基，37℃，150rpm震蕩14-16小時(shí)，提取質(zhì)粒后測(cè)濃度，并測(cè)量出拷貝數(shù)倍比稀釋為10<'7>，10<'6>，10<'5>，10<'4>，10<'3>，10<'2>，10等不同梯度待用。選擇臨床確診的慢性粒細(xì)胞白血病應(yīng)用格列衛(wèi)治療的患者，留取治療

14、前及治療后7天、14天、21天、1個(gè)月、2個(gè)月的外周血，F(xiàn)icol分離單個(gè)核細(xì)胞，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA備用。選取10<'6>，10<'5>，10<'4>，10<'3>，10<'2>，的BCR/ABL和GADPH質(zhì)粒進(jìn)行熒光定量PCR作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用管家基因作為外參照，測(cè)出不同時(shí)期BCR/ABL融合基因表達(dá)水平。 結(jié)果：格列衛(wèi)治療前后不同時(shí)間點(diǎn)，BCR/ABL融合基因的表達(dá)水平呈明顯下降趨勢(shì)，治療前后兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，