蝦肝腸胞蟲(chóng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的建立及其與對(duì)蝦生長(zhǎng)相關(guān)性的研究.pdf

1、蝦肝腸胞蟲(chóng)（Enterocytozoon hepatopenaei）是近幾年新發(fā)現(xiàn)的寄生于對(duì)蝦肝胰腺組織的新病原，2009年泰國(guó)養(yǎng)殖的生長(zhǎng)緩慢的斑節(jié)對(duì)蝦首次發(fā)現(xiàn)并命名。盡管蝦肝腸胞蟲(chóng)不會(huì)引起對(duì)蝦的死亡，但它與對(duì)蝦生長(zhǎng)緩慢有關(guān)。早期死亡綜合征或者急性肝胰腺壞死?。ˋHPND/EMS）引起的蝦高致死率使得人們將更多的注意力集中到AHPND/EMS上面，忽視了蝦肝腸胞蟲(chóng)造成的影響，這使得蝦肝腸胞蟲(chóng)的傳播越來(lái)越廣泛，有信息表明在中國(guó)、印度尼西亞

2、、馬來(lái)西亞、越南、印度和泰國(guó)中都有檢出。本文從實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)方法的建立、人工感染實(shí)驗(yàn)、肝腸胞蟲(chóng)的寄生數(shù)量與對(duì)蝦生長(zhǎng)相關(guān)性幾個(gè)方面進(jìn)行研究。
　　根據(jù)Genbank中公布的對(duì)蝦肝腸胞蟲(chóng)SSU rDNA序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過(guò)對(duì)引物的特異性以及靈敏度檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明引物具有良好的特有性和較高的靈敏度。利用pMD18-T構(gòu)建含有SSU rDNA序列的重組質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行多次優(yōu)化建立了肝腸胞蟲(chóng)SYBR Green實(shí)時(shí)熒

3、光定量PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，構(gòu)建的方法擴(kuò)增循環(huán)數(shù)與目的基因拷貝數(shù)呈良好的線性關(guān)系，且Tm值為60℃時(shí)擴(kuò)增效果最好，熔解曲線僅有一個(gè)單一的特異峰，擴(kuò)增所的擴(kuò)增產(chǎn)物閾值循環(huán)數(shù)(Ct)與模板起始量的對(duì)數(shù)標(biāo)的準(zhǔn)曲線為Ct=-3.369 log(Sq)+39.364，相關(guān)系數(shù)R2=0.992，擴(kuò)增效率為98.5％。利用建立的熒光定量方法檢測(cè)了海南采集的31份個(gè)體生長(zhǎng)大小不均勻的凡納濱對(duì)蝦樣品，肝腸胞蟲(chóng)的陽(yáng)性檢出率為67.7%，高于常規(guī)PCR檢

4、測(cè)，而且通過(guò)溶解曲線分析特異性良好，表明該方法具備較好的適用性。建立的SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法具有特異、靈敏、快速、定量的優(yōu)點(diǎn)，可為肝腸胞蟲(chóng)進(jìn)行快速檢測(cè)以及定量研究提供參考。
　　人工感染實(shí)驗(yàn)利用凡納濱對(duì)蝦幼蝦和鹵蟲(chóng)進(jìn)行，用冰凍和鮮活的的感染有肝腸胞蟲(chóng)的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織去投喂健康的凡納濱對(duì)蝦，投喂一周后的樣品套式 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示投喂冰凍和鮮活肝胰腺組織病料都可以使健康幼蝦感染肝腸胞蟲(chóng)。說(shuō)明肝腸胞蟲(chóng)的孢子

5、能夠抵抗較差的外界環(huán)境，低溫冰凍后仍然具有感染力，這也為生產(chǎn)上肝腸胞蟲(chóng)的預(yù)防和治療帶來(lái)了麻煩。鹵蟲(chóng)感染實(shí)驗(yàn)樣品套式 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示為陰性，利用實(shí)驗(yàn)建立的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示為陽(yáng)性。說(shuō)明肝腸胞蟲(chóng)感染鹵蟲(chóng)后并沒(méi)有在鹵蟲(chóng)體內(nèi)大量繁殖，但是肝腸胞蟲(chóng)可以在鹵蟲(chóng)體內(nèi)寄生存活。
　　在對(duì)蝦肝腸胞蟲(chóng)的流行病學(xué)調(diào)查過(guò)程中，我們采集了山東即墨、江蘇贛榆以及海南儋州三個(gè)地區(qū)生長(zhǎng)緩慢且個(gè)體大小差異明顯的凡納濱對(duì)蝦樣品，并測(cè)量了這幾批凡

6、納濱對(duì)蝦的體長(zhǎng)，懷疑這幾批樣品是因?yàn)楦腥緦?duì)蝦肝腸胞蟲(chóng)而導(dǎo)致其生長(zhǎng)緩慢，并且出現(xiàn)個(gè)體大小差異的明顯癥狀，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法分析了肝腸胞蟲(chóng)對(duì)這幾批凡納濱對(duì)蝦樣品生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)WSSV、IHHNV、CMNV、AHPND四種病原進(jìn)行PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示這幾種病原的檢出率很低。Real-time PCR檢測(cè)肝腸胞蟲(chóng)結(jié)果顯示海南儋州肝腸胞蟲(chóng)檢出率為68%，江蘇贛榆和山東即墨樣品肝腸胞蟲(chóng)全部為陽(yáng)性。利用本方法對(duì)采集自江蘇、海南