肺孢子蟲基因多態(tài)性及實時熒光定量PCR的診斷研究.pdf

1、肺孢子蟲是機會性致病病原體，可在免疫功能低下者引起致命的肺孢子蟲肺炎(Pneumocystispneumonia，PCP)。分子生物學(xué)的研究顯示，不同宿主來源的蟲體具有不同程度的差異或遺傳異質(zhì)性；引起人體肺孢子蟲肺炎的人源肺孢子蟲也存在多種基因型?；蚍中脱芯坑兄谔剿鱌CP的傳染途徑、發(fā)病機制、流行狀況以及耐藥性等問題。國內(nèi)有關(guān)人源肺孢子蟲基因分型的報道較少。PCP傳統(tǒng)的病原學(xué)診斷方法費時、操作繁瑣、檢出率低。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技

2、術(shù)為肺孢子蟲的診斷提供了一個高敏感度的方法。實時熒光定量PCR(Real-TimePCR)為肺孢子蟲的診斷提供了更加快捷、簡便的手段。本文通過3個基因位點的序列分析，研究廣州地區(qū)人源肺孢子蟲的基因多態(tài)性。通過比較肺孢子蟲不同檢測方法的效率，探討實時熒光定量PCR對PCP的診斷價值，為國內(nèi)人源肺孢子蟲的流行病學(xué)研究和PCP的預(yù)防治療提供有價值的參考資料。 收集廣州地區(qū)AIDS人群的支氣管肺泡灌洗液，以ITS1-5.8SrRNA-I

3、TS2、mtISUrRNA和DHPS基因為目的基因，采用單一和巢式PCR檢測肺孢子蟲。獲取目的基因，產(chǎn)物克隆后，各挑取5個測序。分析比較不同基因位點序列的多樣性。比較分析SYBRGreenI實時熒光定量PCR、單一和巢式PCR以及病原學(xué)檢查和臨床診斷方法在診斷PCP和檢測肺孢子蟲中的效率，評價實時熒光定量PCR的實用價值。 通過ITS1-5.8SrRNA-ITS2基因共檢出12個陽性樣本。獲得ITS1基因型3型(E、B和“H”)

4、、9條新序列；獲得ITS2基因型4型(b、g、i和r)、12條新序列；獲得ITS基因型4型(Eg、Eb、Bi和Er)、20種新組合序列，其中“H”r型是新發(fā)現(xiàn)的組合型，未見報道：Eg是最常見ITS基因型；獲得5.8SrRNA基因6條新序列。多基因型混合感染的比例是75％。通過mtLSUrRNA基因檢出6個陽性樣本。在81、85和248的3個位點共分為5型。其中原型CCC所占比例最大，其它4型是CCT、CTC、CAC和CAT。通過DHPS

5、基因檢出10個陽性樣本。DHPS基因翻譯產(chǎn)物在55和57位點均與原型一致，未出現(xiàn)與耐藥性相關(guān)的突變型。獲得DHPS基因21條新序列，16條新氨基酸序列。活檢染色法的靈敏度和特異度是42.9％和100％。ITS1-5.8SrRNA-ITS2基因巢式PCR檢測肺孢子蟲具有較高的靈敏度(85.7％)和特異度(100％)，SYBRGreenI實時熒光定量PCR檢測肺孢子蟲靈敏度(78.6％)和特異度(77.3％)，診斷結(jié)果之間無顯著差異。